VGX-1027抑制PM2.5介導(dǎo)的小鼠肺部炎癥和氣道高反應(yīng)

徐蒙蒙，韓曉燕，李 鋒，王沐昀，張 海，陳宇清，張妍蓓

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽 合肥 230022；2. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院呼吸科，上海 200080；3. 上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院呼吸科，上海 200030)

隨著工業(yè)化和城市化的迅速發(fā)展，空氣污染日益加劇，細(xì)顆粒物(fine particulate matters， PM2.5)作為最主要的空氣污染物，嚴(yán)重威脅著人類健康。流行病學(xué)調(diào)查表明，空氣中PM2.5濃度的升高與咳嗽、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病及癥狀加重密切相關(guān)[1]。PM2.5(空氣動(dòng)力學(xué)粒徑<2.5 μm)極易隨呼吸進(jìn)入肺部，并沉積于遠(yuǎn)端小氣道和肺泡，刺激肺泡上皮和肺部微循環(huán)，可誘導(dǎo)氣道平滑肌收縮和肺部炎癥。最近的研究證實(shí)，PM2.5的鼻腔滴入能夠引起小鼠肺部炎癥和氣道高反應(yīng)[2]。

VGX-1027[(S,R)-3-phenyl-4,5-dihydro-5-isoxasole acetic acid]，分子量為205.21，化學(xué)式為C11H11NO3，其結(jié)構(gòu)式見Fig 1[3]。VGX-1027是一種異惡唑化合物，不溶于水，易溶于乙醇和二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，VGX-1027主要通過調(diào)控Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路，發(fā)揮抗炎作用，同時(shí)也抑制TNF-α的產(chǎn)生[3]。最近的研究表明，VGX-1027通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)路徑，抑制脂多糖引起的腎臟損傷[4]。而PM2.5在引起肺部炎癥反應(yīng)的同時(shí)，也伴隨著TLR4/NF-κB路徑的活化，同時(shí)釋放大量的炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)[5]。本研究旨在探究VGX-1027能否在PM2.5介導(dǎo)的肺部炎癥和氣道高反應(yīng)性模型中發(fā)揮保護(hù)作用。

Fig 1 Structure of (S,R)-3-phenyl-4,5-dihydro-5-isoxasole acetic acid (VGX-1027)

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8～10周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(22～25) g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016。飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院動(dòng)物中心的屏障系統(tǒng)，本研究得到上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，正常飲食，循環(huán)光照。

1.2儀器與試劑小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)(上海玉研儀器公司)；氣道高反應(yīng)儀(Forced Maneuvers系統(tǒng))(英國(guó)EMMS公司)；Shandon Cytospin細(xì)胞離心機(jī)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；蛋白印跡自動(dòng)成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。異氟烷由上海玉研儀器公司提供；劉氏染液，購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；VGX-1027(批號(hào)：S7515)，購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；TNF-α、小鼠CXCL1/KC、IL-1β ELISA試劑盒，均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；NLRP3(批號(hào)：15101S)、NF-κB(批號(hào)：3033S)、phospho-NF-κB(批號(hào)：8242S)、GAPDH(批號(hào)：5174S)抗體，均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；caspase-1抗體(批號(hào)：ab178515)，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3大氣PM2.5采樣及處理2017年10月～2018年4月，于上海市非工業(yè)區(qū)，使用嶗應(yīng)2030型中流量PM2.5采樣器(青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研究所)，采用玻璃纖維濾膜(青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研究所)采集大氣PM2.5，將采集到顆粒物的濾膜置于去離子水中，使用超聲波清洗器洗脫下來，然后冷凍真空干燥，收集PM2.5，-20 ℃干燥保存。使用前，稱取一定量的PM2.5，用PBS緩沖液配制成PM2.5混懸液，超聲震蕩混勻，4 ℃保存。PM2.5具體成分見Tab 1。

Tab 1 PM2.5 composition analysis

TOC: Total organic carbon.

1.4動(dòng)物分組與處理48只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照(PBS)組、VGX-1027+PBS組、PM2.5組、低劑量VGX-1027(12.5 mg·kg-1)+PM2.5組、中劑量VGX-1027(25 mg·kg-1)+PM2.5組和高劑量VGX-1027(50 mg·kg-1)+PM2.5組，每組8只。PBS組、PM2.5組的小鼠置于氣體麻醉機(jī)密封箱中，以異氟烷麻醉后，經(jīng)鼻腔注入50 μL的PBS或者PM2.5混懸液，劑量為7.8 mg·kg-1[6]。VGX-1027+PBS組于鼻腔滴入PBS前1 h腹腔注射VGX-1027(50 mg·kg-1)，VGX-1027+PM2.5組于鼻腔滴入PM2.5混懸液前1 h腹腔注射VGX-1027(12.5、25、50 mg·kg-1)，每天1次，連續(xù)2 d。

1.5氣道反應(yīng)檢測(cè)d 3腹腔注射0.15～0.2 mL的1%戊巴比妥鈉后，小鼠氣管切開，插入氣管導(dǎo)管，置入體積描記箱(Forced Maneuvers系統(tǒng))，并連接電腦控制的呼吸機(jī)，給予一定濃度梯度(0、4、8、16、32、64、128、256 mg·L-1)的乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)霧化吸入，檢測(cè)小鼠的氣道反應(yīng)性。

1.6支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF) 腹腔注射0.4 mL的1%戊巴比妥鈉處死小鼠。應(yīng)用2 mL的PBS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，回收BALF，并離心，重懸細(xì)胞顆粒，計(jì)數(shù)后，在細(xì)胞離心機(jī)制片，采用劉氏染液染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)至少500個(gè)細(xì)胞，并區(qū)分各類炎癥細(xì)胞的比例。

1.7組織病理學(xué)分析左肺用4%福爾馬林灌注、固定，石蠟包埋，厚4 μm切片，進(jìn)行HE染色，評(píng)估支氣管周圍的肺部炎癥積分。0=無炎癥反應(yīng)；1=輕度炎癥反應(yīng)，支氣管壁、血管壁或肺泡間隔有少量炎癥細(xì)胞；2=中度炎癥反應(yīng)，支氣管壁、血管壁、肺泡間隔有成片炎癥；3=重度炎癥反應(yīng)，支氣管壁、血管壁、肺泡間隔有廣泛的炎癥。

1.8細(xì)胞因子檢測(cè)使用ELISA試劑盒，按照說明書操作，檢測(cè)BALF中炎性細(xì)胞因子TNF-α、KC、IL-1β水平。

1.9免疫印跡分析取一定量的小鼠肺組織，以蛋白裂解液研磨，制備10%的組織勻漿液，離心、取上清，蛋白定量、變性。總蛋白上樣量為30 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別用NLRP3、caspase-1、NF-κB、phospho-NF-κB一抗孵育過夜。用對(duì)應(yīng)的 IgG二抗室溫孵育1 h，洗膜后，以ECL發(fā)光液孵育，并置于自動(dòng)成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。運(yùn)用 Image J圖像分析軟件測(cè)定蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1VGX-1027抑制PM2.5介導(dǎo)的氣道高反應(yīng)如Fig 2所示，與PBS組相比，PM2.5鼻腔滴入介導(dǎo)明顯的氣道高反應(yīng)；與PBS組相比，VGX-1027預(yù)處理不影響PBS組的氣道反應(yīng)性。與PM2.5組相比，12.5 mg·kg-1的VGX-1027預(yù)處理組對(duì)PM2.5引起的氣道高反應(yīng)無影響；25、50 mg·kg-1的VGX-1027預(yù)處理組明顯抑制PM2.5介導(dǎo)的氣道高反應(yīng)。

Fig 2 VGX-1027 prevented PM2.5-induced airway hyperresponsiveness n=8)

Mean percentage increase in lung resistance (RL) to increasing concentrations of acetylcholine (Ach).*P<0.05,**P<0.01vsPBS group;#P<0.05,##P<0.01vsVGX-1027(25 mg·kg-1)+PM2.5group;△P<0.05,△△P<0.01vsVGX-1027(50 mg·kg-1)+PM2.5group.

2.2VGX-1027減少PM2.5介導(dǎo)的BALF炎癥細(xì)胞增加Tab 2結(jié)果顯示，與PBS組相比，PM2.5組小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)均增高。與PBS組相比，VGX-1027預(yù)處理不影響PBS組的BALF中細(xì)胞總數(shù)與炎癥細(xì)胞分類。與PM2.5組相比，12.5 mg·kg-1VGX-1027處理后，BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)無明顯變化；25、50 mg·kg-1的VGX-1027處理后，BALF中性粒細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3VGX-1027減輕PM2.5介導(dǎo)的肺部炎癥肺組織HE染色結(jié)果表明，PM2.5組小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺部炎癥積分高于PBS組小鼠。與PBS組相比，VGX-1027預(yù)處理不影響PBS組的肺部病理。與PM2.5組小鼠相比，12.5 mg·kg-1的VGX-1027預(yù)處理組肺部炎癥浸潤(rùn)影響較弱；25、50 mg·kg-1的VGX-1027預(yù)處理組明顯減弱PM2.5介導(dǎo)的肺部炎癥浸潤(rùn)(Fig 3A)，且肺部炎癥積分明顯下降(Fig 3B)。

Tab 2 Differential inflammatory cell counting in BALF (×106 n=8)

**P<0.01vsPBS;#P<0.05,##P<0.01vsPM2.5.

Fig 3 Lung pathological features of HE staining (A) and inflammation scores (B) n=8)

1: PBS; 2: VGX-1027+PBS; 3: PM2.5; 4: VGX-1027(12.5 mg·kg-1)+PM2.5; 5: VGX-1027(25 mg·kg-1)+PM2.5; 6: VGX-1027(50 mg·kg-1)+PM2.5.**P<0.01vsPBS group;#P<0.05,##P<0.01vsPM2.5group.

2.4VGX-1027降低PM2.5介導(dǎo)的炎性因子水平升高Tab 3的ELISA結(jié)果顯示，PM2.5組小鼠BALF中的炎性因子TNF-α、KC、IL-1β水平明顯升高。與PBS組相比，VGX-1027預(yù)處理不影響PBS組的BALF中的炎性因子水平。與PM2.5組相比，12.5 mg·kg-1的VGX-1027預(yù)處理組肺部炎癥因子水平無明顯影響；25、50 mg·kg-1的VGX-1027預(yù)處理組降低PM2.5介導(dǎo)的肺部炎性因子(TNF-α、KC、IL-1β)水平。

2.5VGX-1027抑制PM2.5介導(dǎo)的炎性轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的磷酸化Fig 4的Western blot檢測(cè)顯示，與PBS組相比，PM2.5鼻腔滴入引起小鼠肺組織炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的磷酸化水平升高。與PBS組相比， VGX-1027預(yù)處理不影響PBS組的NF-κB的磷酸化水平。與PM2.5組相比，12.5 mg·kg-1的VGX-1027預(yù)處理對(duì)PM2.5介導(dǎo)的NF-κB的磷酸化水平增高無明顯影響；25、50 mg·kg-1的VGX-1027預(yù)處理，抑制PM2.5介導(dǎo)的NF-κB的磷酸化水平增高。

2.6VGX-1027抑制PM2.5引起的NLRP3炎性小體的表達(dá)和caspase-1的活化Western blot檢測(cè)顯示(Fig 4)，與PBS組相比，PM2.5組小鼠肺組織NLRP3炎性小體和凋亡蛋白酶caspase-1的表達(dá)增強(qiáng)；VGX-1027預(yù)處理不影響PBS組NLRP3和caspase-1的表達(dá)。與PM2.5組相比，12.5 mg·kg-1的VGX-1027預(yù)處理對(duì)PM2.5介導(dǎo)的NLRP3和caspase-1表達(dá)無明顯影響；25、50 mg·kg-1的VGX-1027預(yù)處理，抑制PM2.5介導(dǎo)的NLRP3和caspase-1的表達(dá)。

3 討論

TLR4通路在炎癥過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，主要被細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖所活化，從而誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)性研究表明，PM2.5暴露能夠引起明顯的氣道高反應(yīng)和肺部炎癥，同時(shí)伴隨著TLR4/NF-κB路徑的活化[2, 5]。因此，通過對(duì)TLR4信號(hào)的干預(yù)，可能會(huì)緩解PM2.5引起的肺部炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，在PM2.5介導(dǎo)的肺部炎癥和氣道高反應(yīng)性模型中， VGX-1027(25、50 mg·kg-1)預(yù)處理抑制PM2.5介導(dǎo)的肺部炎癥和氣道高反應(yīng)，同時(shí)抑制TLR4下游信號(hào)NF-κB的磷酸化，以及NLRP3炎性小體的表達(dá)與活化。

Tab 3 Levels of inflammatory factors in BALF (ng·L-1, n=8)

**P<0.01vsPBS;#P<0.05,##P<0.01vsPM2.5

Fig 4 Effects of VGX-1027 on PM2.5-induced lung inflammation determined by Western blot n=8)

*P<0.05,**P<0.01vsPBS group;#P<0.05,##P<0.01vsPM2.5group

在本研究中，PM2.5的急性暴露引起了明顯的氣道高反應(yīng)。氣道高反應(yīng)性是指氣管或支氣管對(duì)一系列藥理的、化學(xué)的、生理的吸入刺激物，產(chǎn)生過分的收縮反應(yīng)。氣道高反應(yīng)性是哮喘和COPD的重要特征。有研究表明，中性粒細(xì)胞在有機(jī)粉塵所引起的肺部炎癥和氣道高反應(yīng)中具有重要的作用[6]。而TNF-α和KC在募集中性粒細(xì)胞的過程中發(fā)揮了重要作用[7]，同時(shí)，TNF-α和IL-1β也可能增強(qiáng)氣道平滑肌的收縮，促進(jìn)氣道高反應(yīng)的發(fā)生[8]。TLR4信號(hào)的活化能夠促進(jìn)一系列炎性基因的表達(dá)，因此，VGX-1027抑制PM2.5引起的氣道高反應(yīng)的發(fā)生可能是通過阻斷TLR4信號(hào)，抑制炎癥基因的表達(dá)，從而減輕氣道平滑肌的收縮反應(yīng)。

吸入性PM2.5黏附于氣道上皮后，可被識(shí)別為病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，進(jìn)而活化TLRs等信號(hào)通路，如TLR4，引發(fā)一系列炎性細(xì)胞因子的釋放，并募集眾多的炎性白細(xì)胞入肺，引發(fā)急性肺部炎癥和免疫紊亂[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中，PM2.5的鼻腔滴入介導(dǎo)小鼠肺部炎細(xì)胞浸潤(rùn)，伴隨巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的計(jì)數(shù)增多。其中，巨噬細(xì)胞可以吞噬肺部侵入性顆粒物，并釋放炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)，招募單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞入肺[11]。同時(shí)，巨噬細(xì)胞膜表面TLR4信號(hào)活化，在髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)的輔助下，促進(jìn)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor-6, TRAF6)的多聚泛素化，驅(qū)使炎性轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的磷酸化，引起炎性基因的表達(dá)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)， PM2.5可引起肺組織炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的磷酸化水平升高，同時(shí)伴有炎性因子(TNF-α、KC、IL-1β)水平明顯升高。VGX-1027能夠明顯下調(diào)PM2.5誘導(dǎo)的NF-κB蛋白的磷酸化，降低TNF-α、KC和IL-1β的水平，減輕肺部炎癥浸潤(rùn)。

此外，黏附于氣道上皮的PM2.5被上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬進(jìn)入細(xì)胞后，導(dǎo)致溶酶體破裂、線粒體受損，進(jìn)而活化NLRP3炎性小體，激活凋亡蛋白酶caspase-1，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)炎癥性死亡——細(xì)胞焦亡[13]。另一方面，活化的caspase-1能夠切割I(lǐng)L-1β前體，促進(jìn)其成熟體的釋放，引起炎癥反應(yīng)[14-15]。本研究中，VGX-1027預(yù)處理抑制PM2.5介導(dǎo)的NLRP3炎性小體的表達(dá)增加及caspase-1的活化，同時(shí)下調(diào)IL-1β的表達(dá)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，VGX-1027能夠減輕PM2.5介導(dǎo)的肺部炎癥和氣道高反應(yīng)。這種保護(hù)性作用可能是由于抑制TLR4/NF-κB信號(hào)路徑和NLRP3炎性小體的活化，為VGX-1027作為新型肺部抗炎藥物的開發(fā)與應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床轉(zhuǎn)化研究院呼吸科實(shí)驗(yàn)室完成。對(duì)所有參與本實(shí)驗(yàn)的研究人員致以誠(chéng)摯的感謝！)