孕期炎癥子代大鼠海馬和皮層COX-2通路的改變

張家化，羅 映，楊 洋，李雨珂，夏 慧，陳志昊，譚曉丹，彭 哲，李苗苗，楊俊卿

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，重慶 400016)

近年來，大量證據(jù)支持“胎兒編程”學(xué)說，即母親孕期宮內(nèi)感染、營養(yǎng)缺乏及激素水平改變等異常因素，均會干擾胎兒編程過程，嚴(yán)重時會導(dǎo)致胎兒發(fā)育的異常、缺陷或成為其出生后潛在致病因素[1-2]。例如，在孕期給予大鼠脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)腹腔注射建立孕期炎癥模型中,子代腎組織DNA甲基化水平增加，伴腎損傷及腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)激活，從而誘發(fā)高血壓[3-4]。證據(jù)顯示，先天免疫系統(tǒng)在胎兒大腦發(fā)育中非常重要，孕婦感染可導(dǎo)致胎兒腦白質(zhì)細(xì)胞死亡和髓鞘形成缺陷[5-6]。胎盤炎癥與早產(chǎn)兒腦損傷密切相關(guān)，且胎盤炎癥程度越重，早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)生風(fēng)險越高[7]。但是，相關(guān)的動物實驗研究的直接證據(jù)較少，最新研究表明，SD大鼠孕期LPS刺激，可導(dǎo)致胎鼠腦水腫和凋亡，以及新生14 d子鼠室周區(qū)脫髓鞘和白質(zhì)損傷[8]。而孕期炎癥子代大鼠皮層及海馬神經(jīng)元是否發(fā)生改變、行為功能是否異常，少見報道。另一方面，孕期炎癥對子代大鼠神經(jīng)系統(tǒng)影響的機制至今尚不清楚，需要深入研究。

大量研究證明，神經(jīng)系統(tǒng)疾病由缺血、缺氧、鈣超載、興奮性氨基酸、氧化應(yīng)激、炎癥因子等多種因素引起[9]。炎癥因子引起神經(jīng)元損傷、凋亡的觀點已被學(xué)者廣泛認(rèn)可。多項流行病學(xué)研究顯示，以環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)為經(jīng)典作用靶點的非甾體抗炎藥，能夠明顯降低老年人發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)疾病的危險性[10]。新近動物實驗研究表明，COX-2下游產(chǎn)物前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)能通過受體調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)大腦的炎癥反應(yīng)程度，對神經(jīng)元功能和存活起決定性作用，提示COX-2途徑有可能作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病干預(yù)的潛在新靶點[11]。因此，本實驗建立孕期炎癥模型，觀察孕期LPS刺激對子代大鼠行為學(xué)、皮層及海馬形態(tài)的影響，并從COX-2及其下游通路初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級SD♀鼠，6～8周齡，體質(zhì)量220～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(渝2012-0001)。子代SD大鼠，由孕鼠繁殖。

1.2試劑LPS購自美國Sigma公司；前列腺素D2(prostglandin D2，PGD2)、PGE2、前列腺素I2(prostglandin I2，PGI2)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和白介素1β(interleukin-1β，IL-1β) ELISA試劑盒，均購自上海源葉公司；COX-2抗體，購自英國Abcam公司；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗，購自武漢三鷹。

1.3儀器Morris水迷宮系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；YLS-1B型多功能大鼠自發(fā)活動記錄儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)；BH-2光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)；全自動酶標(biāo)儀(Spectra MaxM2公司)。

1.4方法

1.4.1動物分組及實驗設(shè)計 8只孕鼠隨機分為生理鹽水(normal saline，NS)[8]組和LPS組，每組4只。LPS組孕鼠在孕期d 11、14、18腹腔注射LPS，每次300 μg·kg-1；NS組孕鼠腹腔注射同容積的生理鹽水。一日3次觀察孕鼠情況，至其生產(chǎn)。出生的子鼠中，每組隨機選取30只新生子鼠并編號，分別記錄它們出生d 3、10、20、30的體質(zhì)量，在d 30時每組隨機選取9只♂鼠進(jìn)行行為學(xué)測試之后，其中每組3只進(jìn)行腦組織病理學(xué)檢查，每組6只進(jìn)行ELISA檢測和Western blot實驗。

1.4.2Morris水迷宮測試 子鼠出生后d 30，采用Morris水迷宮測定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，實驗前讓子代♂大鼠熟悉環(huán)境15 min。整個測試程序分為2個階段：(1)定向航行階段：將大鼠頭朝向水迷宮的池壁放入水中。記錄大鼠第1次登上平臺的時間。大鼠連續(xù)訓(xùn)練4 d，每天每只大鼠訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練間隔15～20 min。(2)空間記憶檢測階段：d 5進(jìn)行測試，將大鼠從最后一次訓(xùn)練的位置放入水中，將平臺撤除，記錄大鼠穿越平臺次數(shù)，并記錄大鼠運動軌跡。

1.4.3曠場實驗 實驗于周圍環(huán)境安靜、可見度為5 m的暗室中進(jìn)行，實驗裝置為內(nèi)部黑漆覆蓋，長、寬、高為100 cm×100 cm×50 cm的木箱，底面均分為25個方格(每個20 cm×20 cm)，子代大鼠被放置于中央方格，記錄其5 min內(nèi)活動情況。①垂直運動(rearing)：兩前爪騰空或攀附墻壁的活動記錄得分。②水平運動(horizontal movement)：穿行的方格數(shù)記錄得分，穿行方格的定義為，大鼠4只腳都進(jìn)入同一格子中。③理毛次數(shù)(grooming)：每只大鼠前爪整理毛發(fā)的次數(shù)。④排泄次數(shù)(excretion)：每只大鼠排泄的次數(shù)。

1.4.4自主活動測試 將各組的子代大鼠放入多功能大鼠自主活動記錄儀中,記錄時室內(nèi)保持安靜，適應(yīng)實驗環(huán)境5 min后,測定大鼠各組自主活動次數(shù),記錄時間為5 min。

1.4.5腦組織病理學(xué)檢查 進(jìn)行Morris水迷宮測試之后，d 2每組隨機選取3只大鼠稱體質(zhì)量，1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，暴露胸腔，先注入PBS沖洗，然后用注入4%多聚甲醛在體灌流固定。將腦組織放入4%多聚甲醛4 ℃固定2 d。取出腦組織，石蠟包埋后進(jìn)行冠狀切片，厚度約5 μm。對石蠟切片進(jìn)行HE染色。顯微鏡光鏡下觀察子代大鼠海馬和皮層神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，并進(jìn)行死亡神經(jīng)細(xì)胞計數(shù)的定量分析。

1.4.6ELISA法測定大鼠海馬和皮層中PGD2、PGE2、PGI2、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量 除進(jìn)行腦組織病理學(xué)檢查的大鼠外，每組剩下6只大鼠全部用1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，斷頭取腦，冰面分離皮層和海馬，-80 ℃保存。取-80 ℃保存的海馬和皮層組織(每組6只)，稱重后，按照重量體積比(W/V)1 ∶9，加入生理鹽水，于冰面進(jìn)行勻漿，制備組織勻漿液，4 ℃、3 000×g離心30 min，收集上清液。從冰箱取出用于分離游離型和結(jié)合型酶標(biāo)記物的濃縮洗滌液[10]，水浴加熱時結(jié)晶溶解，用蒸餾水按1 ∶20稀釋，配制成所需濃度的稀釋洗滌液。取出檢測所需微孔板，室溫條件下平衡20 min。根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，所用試劑均在臨用前新鮮配制，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔及樣品孔，參照ELISA測試盒說明書操作。在反應(yīng)終止后15 min內(nèi)，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測試各孔OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。

1.4.7Western blot測定大鼠海馬和皮層中COX-2蛋白表達(dá) 取-80 ℃保存的海馬、皮層組織，提取各組總蛋白。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，5%胎牛血清封閉4 h。加入相應(yīng)的一抗COX-2、β-actin(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。回收一抗，TBST洗膜，5 min×4次，滴加HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶2 000)，于搖床上室溫孵育2 h。TBST洗膜，5 min×4次，然后用成像分析系統(tǒng)成像并檢測。每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1孕期炎癥子代大鼠體質(zhì)量監(jiān)測如Fig 1所示，體質(zhì)量監(jiān)測從子鼠出生后3 d起至30 d,兩組子鼠體質(zhì)量均隨著天數(shù)的延長而增加,相比于NS組，LPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2孕期炎癥子代大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育情況Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，LPS組子代大鼠d 5逃避潛伏期明顯長于NS組(P<0.05)。與NS組相比，d 5 LPS組子代大鼠穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)。與NS組比較，LPS組子代大鼠運動軌跡明顯延長。曠場實驗主要測試動物在新異環(huán)境中的自主行為和對新環(huán)境的探索力。與NS組相比，LPS組的水平運動明顯減少(P<0.05)，而垂直運動、理毛次數(shù)和排泄次數(shù)差異無顯著性。自主活動測試的結(jié)果顯示，與NS組相比，LPS組的自發(fā)活動明顯減少(P<0.05)。見Fig 2。

2.3孕期炎癥子代大鼠腦組織病理學(xué)變化在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，海馬是與學(xué)習(xí)、記憶功能密切相關(guān)的重要腦區(qū)，也是應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)損傷的主要部位。如Fig 3所示，NS組子代大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞層次清晰，結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，未見明顯核固縮；LPS組子代大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞丟失和(或)核固縮多于NS組(P<0.05)。與海馬特點相似，孕期LPS炎癥組大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞核明顯深染、固縮(P<0.01)。

2.4孕期炎癥子代大鼠海馬和皮層炎性因子含量在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展過程中，COX-2蛋白表達(dá)變化與神經(jīng)系統(tǒng)病變密切相關(guān)，而前列腺素(prostaglandins，PGs)，如PGD2、PGE2、PGI2是由COX-2催化花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝產(chǎn)生。如Fig 4所示，相比于NS組，LPS組大鼠海馬和皮層中PGE2、PGD2和PGI2明顯升高(P<0.01，P<0.05)。TNF-α、IL-6和IL-1β是常見的促炎細(xì)胞因子，通常在炎癥發(fā)生部位存在高濃度的聚集。如Fig 4所示，與NS組相比，LPS組大鼠海馬和皮層中的TNF-α、IL-6和IL-1β在子代大鼠海馬中的含量明顯升高(P<0.01,P<0.05)。

Fig 2 Behavioral changes in offspring rats exposed to LPS during

A:Comparison of the mean escape latencies to find the hidden platform on days 1-5; B:Comparison of the mean in the number of crosses in the MWM on days 5; C:Comparison of each group to find the trajectory of the hidden platform; D:Open field behavior of postnatal day (P)30 rats over 5 min that received LPS or saline on pregnancy(1: Rearing; 2: Horizontal movemet; 3: Grooming; 4: Excretion); E:Spontaneous locomotor activity of P30 rats over 5 min that received LPS or saline on pregnancy.*P<0.05vsNS group.

2.5孕期炎癥子代大鼠海馬和皮層COX-2的蛋白表達(dá)Fig 5的Western blot結(jié)果顯示，與NS組相比，LPS組大鼠海馬及皮層COX-2蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)是機體最復(fù)雜的系統(tǒng)之一，是胚胎發(fā)育過程中不可或缺的一個環(huán)節(jié)。研究表明，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與妊娠期胎兒在子宮內(nèi)生長的環(huán)境密切相關(guān)[1]。流行病學(xué)研究提示，產(chǎn)前感染會增加神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率[8]，原因可能是感染引起母體宿主中促炎細(xì)胞因子的升高，導(dǎo)致胚胎中的一些炎癥因子如TNF-α和IL-1β水平發(fā)生改變。另外，孕期感染可引起子代大鼠腦中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，激活的膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生許多炎性因子，可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強[12]。

Fig 3 Effect of inflammation during pregnancy on hippocampus and cortex in offspring rats(HE×400)

細(xì)胞膜磷脂在磷脂酶A2的作用下生成AA，AA在COX-2作用下生成大量PGs，如PGD2、PGE2、PGI2，介導(dǎo)炎癥的發(fā)生。炎癥在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵性的作用。研究表明，COX-2在正常腦組織中含量低，但在炎癥狀態(tài)的腦組織中占有重要地位[13]。COX-2在一些腦疾病中均有高表達(dá)，如全腦缺血[14]和阿爾茨海默病(Alzheimer’s dis-ease， AD)[15]等。目前，并無相關(guān)研究證實COX-2表達(dá)與孕期炎癥致子代腦損傷的發(fā)病機制相關(guān)。

Fig 4 Changes of PGD2, PGE2, PGI2, TNF-α, IL-6 and IL-1β contents in rat hippocampus(A) and

*P<0.05,**P<0.01vsNS group

**P<0.01vsNS group

本研究觀察孕期子代大鼠出生后，空間學(xué)習(xí)記憶、曠場實驗、自主活動、腦組織病理學(xué)、COX-2及下游PGs的表達(dá)、炎性因子水平等指標(biāo)的改變。結(jié)果顯示，孕期炎癥子代大鼠學(xué)習(xí)記憶功能明顯受損；水平運動和自發(fā)活動次數(shù)明顯減少；海馬和皮層的神經(jīng)細(xì)胞核深染、固縮明顯；COX-2蛋白表達(dá)明顯增加；COX-2催化產(chǎn)物前列腺素PGD2、PGI2和PGE2,以及炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量明顯增加。提示母體孕期炎癥暴露，炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β可能會通過胎盤屏障、血腦屏障，導(dǎo)致子代大鼠處于炎癥狀態(tài)，進(jìn)而引起COX-2激活；激活的COX-2誘導(dǎo)AA生成大量PGs，如PGD2、PGE2和PGI2，這些PGs持續(xù)升高，引起誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iONS)釋放大量具有神經(jīng)毒性的自由基，如一氧化氮(nitric oxide，NO)，最終導(dǎo)致孕期炎癥子代大鼠腦損傷的發(fā)生。因此，COX-2及下游PGs與孕期炎癥子代腦損傷的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但是，具體的分子機制及因果關(guān)系需要采用進(jìn)一步實驗研究加以明確。

綜上所述，孕期炎癥刺激可導(dǎo)致子代大鼠行為學(xué)異常、皮層及海馬神經(jīng)元損傷，其機制可能與COX-2及下游PGs產(chǎn)生有關(guān)。