迷迭香酸類似物-11通過(guò)EGFR-JNK通路抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和遷移

李婉婷，韋立群，李 清，黃道航，潘曉杭，黃俊力，甘嘉亮，唐雙意

(廣西醫(yī)科大學(xué)1. 第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部、2. 藥學(xué)院、3. 第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科、4. 廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530021)

惡性腫瘤作為僅次于心血管疾病的第二大“隱形殺手”，現(xiàn)今已有取而代之的趨勢(shì)。據(jù)估計(jì)，到2025年，全球新增腫瘤數(shù)量將達(dá)到2 000萬(wàn)，嚴(yán)重威脅人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展[1]。有數(shù)據(jù)顯示，以胃癌、肝癌、食道癌為主的消化道腫瘤依然是位居中國(guó)前五的惡性腫瘤, 因此，胃癌仍是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其5年生存率低于30%[2]，尋求新的途徑來(lái)治療胃癌尤為重要。迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一種天然的水溶性苯酚羧酸，化學(xué)成分主要有酚類、萜類、黃酮類等。RA的藥理作用也非常廣泛，包括抗癌、抗菌、抗抑郁、保護(hù)神經(jīng)等[3]。房祥杰等[4]報(bào)道，RA可通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)通路，抑制結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。楊沛霖[5]報(bào)道，迷迭香酸類似物RA-C1能劑量依賴性地抑制人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。從RA多種生物學(xué)效應(yīng)的理論基礎(chǔ)出發(fā)，本研究小組合成了十幾個(gè)迷迭香酸類似物(rosmarinic acid analogue，RAA)。通過(guò)前期的藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸類似物-11(rosmarinic acid analogue-11，RAA-11)在抗腫瘤方面有明顯優(yōu)勢(shì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)Fig 1。因此，本課題進(jìn)一步用RAA-11作用于人胃癌MGC-803細(xì)胞，基于表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)-JNK通路，探討其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)RAA-11提供基礎(chǔ)。

Fig 1 The chemical structure of RAA-11

1 材料

1.1主要試劑及配制RAA-11由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李清老師合成并鑒定(純度≥98%)，用DMSO配制成50 mmol·L-1儲(chǔ)存液，于-20 ℃避光保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM高糖培養(yǎng)基或RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成低、中、高濃度(10、20、40 μmol·L-1)；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；南美胎牛血清，購(gòu)自依科賽生物科技(太倉(cāng))有限公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(含酚紅)、MTT、DMSO，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep Kit購(gòu)自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購(gòu)自日本TaKaRa公司；EGFR mRNA、GAPDH mRNA引物，購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；EGFR、JNK、p-JNK、caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH兔抗人單克隆抗體，購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。

1.2儀器全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；熒光倒置相差顯微鏡(日本尼康公司)；NanoDrop 2000分光光度計(jì)、StepOnePlusTMReal-Time PCR儀(賽默飛世爾科技有限公司)；電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；LI-COR Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和人胃癌細(xì)胞株MGC-803，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。GES-1細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，MGC-803細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，在含有5% CO2飽和濕度的37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)滿后用0.25%胰酶消化用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT法常規(guī)培養(yǎng)人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞和人胃癌MGC-803細(xì)胞，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將其密度調(diào)整為5×107·L-1，接種于96孔板，每孔100 μL。貼壁后，GES-1細(xì)胞加入200 μL用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋的RAA-11(終濃度0、10、20、40、80、160 μmol·L-1)，MGC-803細(xì)胞加入200 μL用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的RAA-11(終濃度0、10、20、40、80、160 μmol·L-1)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、36、48 h后，每孔加入20 μL MTT，置孵箱中孵育4 h后，加100 μL DMSO并劇烈震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm波長(zhǎng)處各孔的OD值。細(xì)胞存活率=OD加藥組/OD對(duì)照組×100%。

2.3劃痕實(shí)驗(yàn)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌 MGC-803細(xì)胞，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基將其密度調(diào)整為1.5×108·L-1，接種到6孔板，每孔2 mL。貼壁后棄培養(yǎng)基，用馬克筆在6孔板背面劃?rùn)M線，小槍頭在細(xì)胞上垂直于馬克筆跡劃豎線。用PBS洗下劃掉的細(xì)胞，每孔分別加入2 mL用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的RAA-11(終濃度0、10、20、40 μmol·L-1)，拍照0、24、36、48 h劃痕寬度(L)，計(jì)算細(xì)胞遷移情況。細(xì)胞遷移率=(L0 h-Ln h)/L0 h×100%，n=24、36、48。

2.4熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR) 消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待其長(zhǎng)到80%～90%左右，每瓶分別加入3 mL用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的RAA-11(終濃度0、10、20、40 μmol·L-1)。藥物作用48 h后，收集細(xì)胞上清液，并消化貼壁細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取MGC-803細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度后置于-80 ℃保存。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增。EGFR引物序列：Forward 5′-CCTGGTCTGGAAGTACGCAG-3′，Reverse 5′-CGATGGACGGGATCTTAGGC-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列：Forward 5′-GTCTTCACCACCATGGAGAAG-3′，Reverse 5′-GTTGTCATGGATGACCTTGGC-3′。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)相對(duì)定量方法分析，計(jì)算2-ΔΔCt值，比較組間基因表達(dá)水平是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5Westernblot檢測(cè)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌MGC-803細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待其長(zhǎng)到80%～90%左右，每瓶分別加入用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的RAA-11(終濃度0、10、20、40 μmol·L-1)3 mL。藥物作用48 h后，收集細(xì)胞上清液，并消化下貼壁細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液(RIPA ∶PMSF ∶Cocktail=100 ∶1 ∶1)于冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min。上清液用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，加上樣緩存液煮沸變性10 min。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST洗膜3次，5% BSA室溫封閉30 min，一抗4 ℃孵育36 h。二抗室溫避光孵育1 h，TBST避光洗膜3次后，于Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)上機(jī)掃膜，計(jì)算灰度值后分析數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1RAA-11對(duì)GES-1細(xì)胞和MGC-803細(xì)胞增殖的抑制作用如Fig 2所示，與GES-1細(xì)胞相比，RAA-11能明顯抑制MGC-803細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間濃度依賴性，提示RAA-11對(duì)MGC-803細(xì)胞有選擇作用。線性回歸得到RAA-11作用GES-1細(xì)胞24、36、48 h的IC50分別是289.425、220.430、189.521 μmol·L-1；作用MGC-803細(xì)胞24、36、48 h的IC50分別是72.781、59.979、40.625 μmol·L-1。

Fig 2 Effect of RAA-11 on survival rate at different concentrations at different

A:Human gastric mucosa cells GES-1; B:Human gastric cancer cells MGC-803.

3.2RAA-11對(duì)MGC-803細(xì)胞遷移的抑制作用如Fig 3所示，實(shí)驗(yàn)各組在0 h時(shí)，劃痕寬度基本接近(P>0.05)。隨著時(shí)間的推移(24、36、48 h)，與對(duì)照組相比，MGC-803細(xì)胞的遷移率隨著RAA-11濃度增加明顯降低(P<0.01)，且呈時(shí)間濃度依賴性。提示RAA-11可抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞的遷移能力。

3.3RAA-11對(duì)MGC-803細(xì)胞EGFRmRNA表達(dá)的影響如Fig 4所示，RAA-11作用于MGC-803細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，EGFR mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。結(jié)果提示RAA-11抑制MGC-803細(xì)胞的增殖和遷移可能與EGFR基因有關(guān)。

3.4RAA-11對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 5所示，與對(duì)照組比較，RAA-11作用于MGC-803細(xì)胞48 h后，促凋亡蛋白caspase-3和Bax表達(dá)增加，同時(shí)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低，表明RAA-11可誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞的凋亡。

Fig 3 Effect of RAA-11 on migration rate of human gastric cancer MGC-803 cells at different concentrations at different

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

Fig 4 Effect of different concentrations of RAA-11 on expression level of EGFR mRNA in human gastric

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

3.5RAA-11對(duì)MGC-803細(xì)胞EGFR-JNK通路蛋白表達(dá)的影響如Fig 6所示，與對(duì)照組比較，RAA-11作用于MGC-803細(xì)胞48 h后，通路蛋白EGFR明顯下調(diào)，JNK、p-JNK表達(dá)明顯上升。提示RAA-11可能通過(guò)作用EGFR-JNK通路，抑制MGC-803細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)其凋亡。

Fig 5 Effect of different concentrations of RAA-11 on expression of apoptosis related proteins in human

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

Fig 6 Effect of different concentrations of RAA-11 on expression of EGFR-JNK pathway proteins in human

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

4 討論

與壞死不同，細(xì)胞凋亡(或稱程序性細(xì)胞死亡)是細(xì)胞與生俱來(lái)的一種機(jī)制，借此機(jī)體可去除不需要的細(xì)胞[6]。caspases是細(xì)胞凋亡的重要介導(dǎo)因子，caspase-3作為caspases家族執(zhí)行階段的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，有研究證實(shí)，caspase-3在人腫瘤組織和細(xì)胞系中存在突變[7]。其下游因子Bcl-2是一種癌基因，可分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。在各種凋亡刺激下，促凋亡蛋白Bax通過(guò)誘導(dǎo)線粒體外膜通透性和釋放凋亡所需的可溶性因子，觸發(fā)內(nèi)在凋亡通路[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RAA-11能夠抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)凋亡啟動(dòng)因子caspase-3以及促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，所以我們認(rèn)為RAA-11可以誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡。

EGFR又稱ERBB1和HER1，是一種跨膜酪氨酸激酶受體。EGFR是人類表皮受體(HER)家族的一員，是細(xì)胞信號(hào)通路的重要組成部分[9]。研究表明，抑制EGFR信號(hào)通路可誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞衰老[10]，EGFR在腫瘤生長(zhǎng)中起著至關(guān)重要的作用[11]。EGFR通常位于細(xì)胞膜表面，當(dāng)受到某些刺激時(shí)，可以激活它位于細(xì)胞內(nèi)的激酶通路，誘導(dǎo)其下游通路的磷酸化，包括MAPK、Akt、STAT3通路,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RAA-11從基因和蛋白水平均下調(diào)了EGFR的表達(dá)，表明RAA-11抑制MGC-803細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)其凋亡與EGFR通路有關(guān)。

JNK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的成員之一，其中JNK家族包括10個(gè)由3個(gè)基因編碼的亞型:JNK1(4個(gè)亞型)、JNK2(4個(gè)亞型)和JNK3(2個(gè)亞型)。JNK1和JNK2存在于身體的所有細(xì)胞和組織中，而JNK3主要在心臟、大腦和睪丸中表達(dá)。眾多研究表明，JNK在炎癥、凋亡、壞死信號(hào)通路的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[12]。JNK誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)線粒體途徑發(fā)揮作用，誘導(dǎo)細(xì)胞色素釋放入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，既可促進(jìn)多種凋亡蛋白的表達(dá)，又可作用于Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax、Bak等，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的途徑[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RAA-11明顯下調(diào)了通路蛋白EGFR的表達(dá)水平，并上調(diào)了通路蛋白JNK、p-JNK的表達(dá)量，我們猜想RAA-11可能通過(guò)EGFR-JNK通路來(lái)抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明RAA-11對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖、遷移有明顯的抑制作用，并能夠誘導(dǎo)其凋亡，機(jī)制可能與EGFR-JNK通路有關(guān)。結(jié)合前期研究，我們認(rèn)為RAA-11通過(guò)多條通路對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)科技樓基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室完成，由衷感謝各位老師和同學(xué)的幫助！)