白藜蘆醇通過下調(diào)MnSOD誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡

汪陶榮，張 曄，曹 威，張俊強(qiáng)，殷曈昕，朱皓晨，蘇逸明，陳思嫻，瞿子庭，王高遠(yuǎn)，張麗霞，陳曉宇，2

(安徽醫(yī)科大學(xué)1. 組織胚胎學(xué)教研室、2. 形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心、3. 臨床醫(yī)學(xué)院、4. 藥學(xué)院，安徽 合肥 230032；5. 第一附屬醫(yī)院骨科，安徽 合肥 230022)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)屬于自身免疫性疾病，病情反復(fù)發(fā)作，導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷，甚至致殘[1]。RA的特殊病因是成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)異常增殖，F(xiàn)LSs在關(guān)節(jié)損傷中起關(guān)鍵作用[2]。RA的發(fā)病與氧自由基生成有關(guān)[3]，活性氧(reactive oxygen species, ROS)在生理狀態(tài)下主要是由線粒體生成，即線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species, mtROS)，研究表明，mtROS與RA等疾病的病理生理學(xué)有關(guān)[4]。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種天然的多酚類化合物，它廣泛存在于葡萄、虎杖等植物中[5]。低濃度的Res能降低mtROS，減少ROS引起的脂質(zhì)過氧化和DNA損傷，高濃度Res可引起細(xì)胞凋亡[6]。Res可活化線粒體去乙酰化家族的去乙?；?(sirtuin 3, SIRT3)，SIRT3通過調(diào)節(jié)錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, MnSOD)的去乙?；饔?，調(diào)節(jié)mtROS平衡和能量代謝[7]。該文主要研究Res通過MnSOD-mtROS途徑影響RA的FLSs增殖和凋亡，為RA的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞與試劑 RA-FLSs細(xì)胞系(編號C0495)，購自上海冠導(dǎo)生物有限公司。Res(批號R5010,分子量228.24)，購自美國Sigma公司；DMEM(10569-010)，購自美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(04-001-1ACS)，購自美國BI公司；兔抗人MnSOD(ab13533)、GAPDH(ab9485)，購自美國Abcam公司；Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BB-41012-3)，購自上海貝博生物公司；CCK-8試劑盒(C0037)，購自碧云天生物有限公司；Mito SOX紅色探針(40778ES50)，購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.1.2儀器 MultikanFC型酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾公司)；激光八色流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；Thermo Forma4111CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國熱電公司)；LEICA.SP5-DMI6000-DIC共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠)；TS2R-FL熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) RA-FLSs用含10% FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞長到80%左右密度時(shí)，用5 μmol·L-1H2O2處理12 h后，再用Res處理24 h。

1.2.2慢病毒感染細(xì)胞 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定復(fù)感染指數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為50。用完全培養(yǎng)基制備密度為3×107·L-1的細(xì)胞懸液，種到6孔板中，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h，加入50 μL 1×108TU病毒、40 μL 25×HitransG慢病毒感染試劑、910 μL完全培養(yǎng)基。感染12 h后，應(yīng)用常規(guī)培養(yǎng)基。感染48 h后，加入嘌呤霉素篩選，通過殺死曲線確定濃度為8 mg·L-1。感染72 h后，熒光倒置顯微鏡觀察感染效果。

1.2.3mtROS水平測定 mtROS水平檢測應(yīng)用Mito SOX Red探針。在50 μg Mito SOX Red中加入13 μL DMSO，混勻配制成5 mmol·L-1的Mito SOX Red工作液。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按照2×105/孔細(xì)胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長密度至80%左右時(shí)，H2O2作用12 h后, Res作用24 h，PBS洗滌2次，加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的Mito SOX Red工作液，終濃度為5 μmol·L-1的探針工作液2 mL，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育15 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，立即行激光共聚焦掃描顯微鏡觀察攝片。

1.2.4CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將對數(shù)生長期的RA-FLSs接種于96孔板中，每孔加入100 μL(2 000個(gè)細(xì)胞)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，次日細(xì)胞貼壁后，5 μmol·L-1H2O2預(yù)處理細(xì)胞12 h，Res處理24 h后,細(xì)胞培養(yǎng)液作為對照組。每孔加入10 μL CCK-8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度A值。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 采用流式細(xì)胞儀結(jié)合AnnexinV-PE/AAD試劑盒雙標(biāo)記染色，測定細(xì)胞凋亡率。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按照2×105/孔細(xì)胞接種于6孔板，依照上述H2O2濃度和Res濃度分組，胰酶消化收集細(xì)胞。按照試劑盒說明操作：冷PBS洗滌細(xì)胞2次，用400 μL Annexin V結(jié)合液，調(diào)整密度約1×109·L-1，加入5 μL AnnexinV-PE染色液，輕輕混勻，(2～8) ℃避光孵育15 min，然后加入10 μL AAD染色液，輕輕混勻，(2～8) ℃避光孵育5 min，行流式細(xì)胞儀分析。

Fig 1 Effects of resveratrol on RA-FLSs

*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group

Fig 2 Effect of resveratrol on expression

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group

1.2.6免疫印跡分析 取對數(shù)生長期細(xì)胞, 按照2×105/孔細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長密度至80%左右時(shí)。同上加藥處理后，將6孔板置于冰上，每孔加入增強(qiáng)型RIPA裂解液(含1 mmol·L-1蛋白酶抑制劑、PMSF)150 μL作用1 min，提取總蛋白，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，BCA蛋白試劑盒蛋白定量后，再進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃孵育MnSOD(1 ∶5 000)、GAPDH(1 ∶2 500)抗體；過夜后，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光曝光3～5 min，顯影。

2 結(jié)果

2.1Res抑制RA-FLSs增殖不同濃度的Res作用于RA-FLSs，CCK-8法檢測其增殖情況，5 μmol·L-1H2O2刺激FLSs模擬體外氧化應(yīng)激環(huán)境。如Fig 1所示，5 μmol·L-1H2O2細(xì)胞活力明顯高于對照組(t=3.385，P=0.0277)，然后加入不同濃度的Res，發(fā)現(xiàn)隨著Res濃度的增加，RA-FLSs的細(xì)胞活力降低越來越明顯(F=16.99，P=0.008)。

2.2Res降低RA-FLSs內(nèi)MnSOD的表達(dá)如Fig 2所示，與對照組比較，5 μmol·L-1H2O2組MnSOD蛋白表達(dá)升高(t=4.750,P=0.009)，給予不同濃度的Res處理之后,MnSOD蛋白表達(dá)逐漸降低，并且呈現(xiàn)濃度依賴性(F=17.54，P=0.0007)。

2.3慢病毒載體成功感染了RA-FLSs用MnSOD過表達(dá)和MnSOD干擾慢病毒載體同時(shí)感染RA-FLSs，72 h后用熒光倒置顯微鏡觀察慢病毒載體攜帶的綠色熒光標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)感染效率均在60%以上。因?yàn)檩d體攜帶嘌呤霉素抗性基因，用8 mg·L-1(濃度由死亡曲線確定)的嘌呤霉素進(jìn)行篩選后，感染效率達(dá)到90%(Fig 3)。為了檢測MnSOD過表達(dá)慢病毒和MnSOD干擾慢病毒是否增加或降低RA-FLSs中MnSOD蛋白表達(dá)，Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，MnSOD干擾慢病毒感染的RA-FLSs中MnSOD的蛋白水平表達(dá)下調(diào)(t=4.651，P=0.0097)，MnSOD過表達(dá)病毒感染的RA-FLSs中MnSOD的蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(t=4.242，P=0.0132)。證實(shí)慢病毒成功感染了目的細(xì)胞，并上調(diào)或下調(diào)了MnSOD的表達(dá)。

2.4MnSOD調(diào)節(jié)mtROS水平H2O2處理對照組、MnSOD過表達(dá)慢病毒感染組、MnSOD干擾慢病毒感染組的RA-FLSs用相關(guān)因素處理12 h后，再用200 μmol·L-1的Res分別孵育24 h，MitoSOX紅色探針檢測各組細(xì)胞mtROS水平。Fig 4結(jié)果表明，與模型組相比，在相同濃度Res處理下，MnSOD過表達(dá)組mtROS的水平降低(t=5.117，P=0.0069)，而MnSOD干擾組結(jié)果相反(t=4.852，P=0.0083)。

Fig 3 RA-FLSs infected by lentiviral vector

Fig4mtROSlevelsmediatedbyMnSODregulation(×400) A:Control group; B: Model group; C: Model+200 μmol·L-1Res group; D: MnSOD overexpression+200 μmol·L-1Res group; E: MnSOD interference+200 μmol·L-1Res group.**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vsmodel+200 μmol·L-1Res group.

2.5MnSOD抑制RA-FLSs凋亡采用AnnexinV-PE/AAD試劑盒，流式細(xì)胞儀檢測Res對5 μmol·L-1H2O2處理的不同組RA-FLSs凋亡的影響。如Fig 5所示，Res促進(jìn)RA-FLSs凋亡，而MnSOD過表達(dá)組則在同種濃度的Res處理下，凋亡率減少(t=4.691，P=0.0094)；MnSOD干擾組凋亡率增加(t=4.100，P=0.0149)。

3 討論

本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[7]，Res可以抑制RA-FLSs增殖，采用5 μmol·L-1H2O2刺激FLSs模擬體外氧化應(yīng)激環(huán)境，在加入不同濃度的Res后，發(fā)現(xiàn)隨著Res濃度的增加，F(xiàn)LSs的細(xì)胞活力明顯降低。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測Res對RA-FLSs凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)隨著Res濃度增加，F(xiàn)LSs的凋亡逐漸增高。同時(shí)，線粒體超氧化物檢測試劑盒結(jié)果顯示，加入不同濃度的Res之后，RA-FLSs中mtROS的紅色熒光逐漸增強(qiáng)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合上述mtROS在Res處理的RA-FLSs含量和凋亡數(shù)據(jù)，提示Res很可能通過改變RA-FLSs的mtROS含量，產(chǎn)生過多的mtROS，導(dǎo)致異常增殖RA-FLSs的凋亡。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[7]，Res降低線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白SIRT3和MnSOD的表達(dá)，Res處理后，SIRT3和MnSOD蛋白表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性降低。結(jié)合Res增高mtROS水平的結(jié)果，提示Res可能通過作用于線粒體中的SIRT3和MnSOD蛋白，升高mtROS水平，最終引起細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證Res是否可以通過SIRT3-MnSOD信號途徑調(diào)節(jié)mtROS水平，促進(jìn)H2O2處理的RA-FLSs凋亡，本研究構(gòu)建MnSOD過表達(dá)和干擾的慢病毒載體，使RA-FLSs的MnSOD表達(dá)活化和抑制，結(jié)果證實(shí)，Res可以通過SIRT3-MnSOD信號途徑調(diào)節(jié)mtROS水平。

RA患者的FLSs失去控制的增長和死亡失衡是RA的特殊病征，促進(jìn)RA的FLSs凋亡將是RA治療的主要干預(yù)措施[8-9]。線粒體凋亡途徑是主要的凋亡途徑，在線粒體凋亡途徑中，線粒體主要是增加了ROS的生成[10]。本研究結(jié)果證明，活化或抑制MnSOD表達(dá)后，200 μmol·L-1Res處理RA-FLSs后，ROS發(fā)生明顯變化，從而對凋亡產(chǎn)生影響。在此實(shí)驗(yàn)中，我們猜想Res介導(dǎo)mtROS生成增多可能是RA-FLSs的特殊特征。

綜上，本研究證實(shí)Res可能通過MnSOD-mtROS信號通路，抑制RA-FLSs增殖。圍繞mtROS,明確mtROS在H2O2誘導(dǎo)的FLSs增殖中作用，通過體外實(shí)驗(yàn)探明Res對FLSs增殖的影響，探明MnSOD-mtROS信號途徑在Res抑制RA-FLSs增殖中的作用及機(jī)制，為RA的形成機(jī)制和藥物設(shè)計(jì)提供新靶點(diǎn)，是針對RA的一種潛在的治療方法。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心、組胚實(shí)驗(yàn)室完成，在此對實(shí)驗(yàn)室各位老師及同學(xué)的幫助致以衷心的感謝！)