HIV-1衣殼蛋白抑制劑體外篩選方法研究進(jìn)展

張大為，許曉雙，常 珊

(江蘇理工學(xué)院生物信息與醫(yī)藥工程研究所，江蘇 常州 213001)

人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)是艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的病原體[1]。HIV主要有2種亞型：HIV-1和HIV-2，后者具有更高的毒力和傳染性，導(dǎo)致了全球大多數(shù)國(guó)家的HIV感染[2]。AIDS是全球最為致命的傳染性疾病之一，目前仍無(wú)法治愈。30年來(lái)，經(jīng)美國(guó) FDA批準(zhǔn)上市的抗HIV-1藥物多達(dá)30余種，這些藥物的聯(lián)用(亦被稱(chēng)為高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法)使得艾滋患者的死亡率大幅下降，壽命得到了極大延長(zhǎng)，AIDS甚至已經(jīng)被“馴服”成一種慢性傳染性疾病[3]。然而，由于存在患者依從性差、藥物副作用大和耐藥性病毒株等諸多問(wèn)題，使得AIDS治療的效果明顯降低[4]。因此，尋找具有優(yōu)良特點(diǎn)(比如毒副作用小、便于給藥、耐藥基因屏障高)的新一代抗HIV-1藥物顯得非常必要。

1 衣殼蛋白(capsid protein, CA)是理想的抗病毒藥物靶點(diǎn)

HIV-1為逆轉(zhuǎn)錄病毒，將RNA和重要的病毒蛋白包裹于衣殼中，是該類(lèi)病毒的重要特征。衣殼由CA組裝而成。近年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到HIV-1衣殼在病毒復(fù)制過(guò)程中并非是一個(gè)“小角色”，而是一個(gè)重要的“多面手”[5]：參與病毒的逆轉(zhuǎn)錄；病毒基因組的核輸入及整合；防止固有免疫效應(yīng)器的激活。病毒衣殼的組裝和穩(wěn)定性均會(huì)影響HIV-1病毒分子的自我復(fù)制和感染性，因此，CA成為潛在的藥物作用靶點(diǎn)。目前，已有研究報(bào)道了若干靶向CA的抑制劑，只有Gilead Sciences公司宣布其開(kāi)發(fā)的CA抑制劑 GS-CA1進(jìn)入了I期臨床試驗(yàn)[6]。盡管沒(méi)有一種CA抑制劑被批準(zhǔn)用于臨床，但是這些已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CA抑制劑卻有力地證明了CA是開(kāi)發(fā)抗病毒藥物的有效靶點(diǎn)。此外，與HIV-1病毒的其它蛋白相比，CA蛋白序列相對(duì)保守。通過(guò)構(gòu)建單點(diǎn)氨基酸殘基突變庫(kù)發(fā)現(xiàn)，70%的CA殘基在發(fā)生突變后，會(huì)導(dǎo)致病毒喪失感染性，CA表現(xiàn)出極度的遺傳脆弱性(genetic fragility)[7]。CA的遺傳脆弱性能在一定程度上降低耐藥性的出現(xiàn)，也提示我們?cè)趯ふ褻A抑制劑的時(shí)候，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注CA蛋白遺傳脆弱性最為嚴(yán)重的位點(diǎn)。綜上所述，CA是一個(gè)理想的藥物作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)CA抑制劑具有重要意義。

2 HIV-1衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)

HIV衣殼由大約1 500個(gè)CA蛋白單體組裝而成。CA源于病毒gag結(jié)構(gòu)基因編碼的前體蛋白，由N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，NTD)、C端結(jié)構(gòu)域(C- terminal domain，CTD)和中間的柔性部分組成[8]。NTD由150個(gè)氨基酸殘基組成，CTD由70個(gè)氨基酸殘基組成，前者主要由α-螺旋、β發(fā)卡結(jié)構(gòu)和親環(huán)素A結(jié)合環(huán)組成，后者則包括α-螺旋、310螺旋和保守區(qū)域MHR。CA的NTD相互作用，形成環(huán)形六聚體(hexamer, HA)和五聚體(pentamer, PA)，HA或PA再通過(guò) CTD之間的相互連接，形成網(wǎng)狀晶格。最終，由大約250個(gè) HA和12個(gè)PA組成了圓錐形的“富勒烯”型衣殼[5]。HIV-1衣殼的分解和組裝依賴(lài)于CA兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用[9]。

3 HIV-1的CA抑制劑篩選方法

簡(jiǎn)單有效的藥物篩選方法是發(fā)現(xiàn)CA抑制劑的前提。目前，已有研究報(bào)道了基于不同技術(shù)的多種CA抑制劑的篩選方法。本文將對(duì)這些篩選方法進(jìn)行綜述。

3.1非同位素標(biāo)記非均相篩選法在體外，CA組裝成與真實(shí)病毒類(lèi)似的富勒烯的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)需要苛刻的反應(yīng)條件：高濃度CA和高離子強(qiáng)度(> 1 mol·L-1NaCl)緩沖液，限制了其直接應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，在脫氧寡核苷酸存在下，較低濃度的HIV-1 Gag蛋白就能夠在低離子強(qiáng)度的緩沖液中完成組裝?；诖嗽?，研究人員設(shè)計(jì)了一種在體外高通量篩選CA抑制劑的方法：將5′端標(biāo)記生物素(biotin)的脫氧寡核苷酸d(TG25)固定到中性親和素(neutravidin)包被的黑色384孔板，過(guò)夜孵育，洗去未結(jié)合的biotin-d(TG25)，加入5′端標(biāo)記熒光素(fluorescein)的脫氧寡核苷酸d(TG25)和CA-NC蛋白。溶液中的fluorescein-d(TG25)引發(fā)CA-NC組裝，之后fluorescein-d(TG25)-CA-NC復(fù)合物會(huì)結(jié)合至biotin-d(TG25)。通過(guò)檢測(cè)熒光，將實(shí)現(xiàn)對(duì)CA-NC組裝的檢測(cè)。如果CA-NC組裝被小分子抑制，fluorescein-d(TG25)和CA-NC將一同被洗掉，無(wú)法檢測(cè)到熒光信號(hào)，CA-NC的組裝數(shù)量與熒光信號(hào)呈正相關(guān)(Fig 1)[10]。使用該方法，他們發(fā)現(xiàn)苯二氮類(lèi)(benzodiazepines)和苯并咪唑類(lèi)化合物具有抑制CA組裝的活性。該篩選方法采用生物素-親和素系統(tǒng)，優(yōu)點(diǎn)是：結(jié)合牢固，信號(hào)多級(jí)放大，操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)高通量篩選。缺點(diǎn)是：親和素包被的微孔板和熒光標(biāo)記的脫氧寡核苷酸底物，易造成非特異性吸附，需要通過(guò)洗板消除背景信號(hào)造成的干擾。

3.2同位素標(biāo)記均相篩選法鄰近閃爍分析(scintillation proximity assay, SPA)是通過(guò)檢測(cè)放射性同位素衰變中產(chǎn)生的β射線(xiàn)激發(fā)閃爍劑發(fā)光，實(shí)現(xiàn)對(duì)分子相互作用檢測(cè)的一種技術(shù)，被廣泛用于藥物篩選中。有研究發(fā)現(xiàn)，在體外，化合物PF-3450074(PF74)能與CA六聚體發(fā)生高親和力結(jié)合(Kd值為262 nmol·L-1)[11]。為了篩選能夠競(jìng)爭(zhēng)PF74結(jié)合位點(diǎn)的抑制劑，研究人員基于SPA技術(shù)，設(shè)計(jì)了一種高通量的CA抑制劑篩選方法(Fig 2)：先在體外準(zhǔn)備好生物素化的CA六聚體(bhCA-1)，然后將bhCA-1、鏈霉親和素包被的SPA微珠和3H同位素標(biāo)記的PF74([3H]PF74)加入384孔板中孵育。沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)性小分子存在的時(shí)候，3H標(biāo)記的PF74與CA六聚體結(jié)合，同位素3H衰變產(chǎn)生的弱β粒子將其能量轉(zhuǎn)移給SPA微珠表面的閃爍劑，激發(fā)閃爍劑發(fā)射光子并被檢測(cè)器記錄；當(dāng)沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)性小分子存在時(shí)，[3H]PF74將很少甚至不會(huì)結(jié)合到CA六聚體，3H衰變產(chǎn)生的弱β粒子因距離關(guān)系(>1.5 μm)無(wú)法將其能量轉(zhuǎn)移給SPA微珠表面的閃爍劑，檢測(cè)信號(hào)減弱或者消失[12]。該法的優(yōu)點(diǎn)是：無(wú)需離心、洗滌和過(guò)濾等物理過(guò)程，靈敏、快速、均相，信號(hào)穩(wěn)定，技術(shù)成熟，能用于高通量篩選，篩選得到的化合物結(jié)合位點(diǎn)明確。不足之處在于：實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的同位素污染物需要特殊處理，檢測(cè)信號(hào)易受小分子自身發(fā)色基團(tuán)的影響而淬滅；SPA微珠表面會(huì)因非特異性吸附同位素標(biāo)記的配體而產(chǎn)生非特異性信號(hào)；SPA 技術(shù)所用到的材料都非常昂貴，且為少數(shù)幾家美國(guó)公司所壟斷。

Fig 1 Schematic representation of in vitro capsid assembly assay based on association of CA-NC subunits on immobilized oligonucleotides d (TG25)

Fig 2 Diagram of SPA-based assay strategy[12]

3.3非同位素標(biāo)記均相篩選法

3.3.1均相時(shí)間分辨熒光法(homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF) HTRF技術(shù)是研究蛋白-蛋白相互作用的常用技術(shù)。研究人員基于HTRF設(shè)計(jì)了一種高通量的CA抑制劑篩選方法(Fig 3)：將GST-CA CTD、CA CTD-Flag、待測(cè)化合物、Anti-6His-XL665熒光受體和Anti-GST Cryptate熒光供體一起孵育，在320 nm激光照射下，熒光供體吸收部分能量，產(chǎn)生波長(zhǎng)為620 nm的熒光；當(dāng) GST-CA 和 CA-Flag形成二聚體時(shí)，拉近熒光供體和受體的距離，熒光受體受到轉(zhuǎn)移過(guò)來(lái)的能量激發(fā)，發(fā)射出波長(zhǎng)為665 nm的熒光；當(dāng)有抑制劑存在時(shí)，GST-CA 和 CA-Flag不能形成二聚體，熒光受體不被激發(fā)，在665 nm處沒(méi)有熒光信號(hào)產(chǎn)生，只有620 nm處的熒光信號(hào)[13]。該高通量篩選的Z因子為0.89，是一個(gè)非常理想的抑制劑篩選方法。應(yīng)用該方法，他們從1 280個(gè)化合物中篩選到了1個(gè)活性分子依布硒啉(ebselen)。該篩選方法的優(yōu)點(diǎn)是高通量、無(wú)需固相檢測(cè)方法中的包被和洗板步驟，因此耗時(shí)短、靈敏度高，實(shí)時(shí)分辨熒光的引入，避免了化合物的自發(fā)熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。不足之處是受檢測(cè)距離(8～10 nm，相當(dāng)于60～80 ku的蛋白復(fù)合物)限制，無(wú)法檢測(cè)分子量過(guò)大的蛋白-蛋白相互作用復(fù)合物。

Fig 3 Schematic representation of HTRF assay [13]

3.3.2放大化學(xué)發(fā)光接近均相檢測(cè)(amplified luminescent proximity homogeneous assay, ALPHA) ALPHA技術(shù)主要依賴(lài)于經(jīng)過(guò)特殊處理的供體微珠(含光敏劑苯二甲藍(lán))和受體微(含二甲基噻吩、蒽、紅熒烯)。當(dāng)熒光供體和受體因蛋白-蛋白相互作用，彼此距離小于200 nm時(shí)，會(huì)引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生放大的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)。研究者利用ALPHA技術(shù)建立了一種高通量的CA抑制劑篩選方法(Fig 4)：將GST-CA、CAI-biotin、Streptavidin-微珠(供體)、化合物以及GSH-微珠(受體)加入微孔板孵育，供體在激發(fā)光(680 nm激光)照射下產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧。當(dāng)GST-CA/AI-biotin形成異二聚體時(shí)，會(huì)拉近熒光供/受體的距離，使得單線(xiàn)態(tài)氧能夠有效的激發(fā)熒光受體產(chǎn)生熒光(波長(zhǎng)為520～620 nm)，反之，當(dāng)抑制劑干擾GST-CA和CAI-biotin形成異二聚體，單線(xiàn)態(tài)氧因距離原因無(wú)法擴(kuò)散至受體微珠，不能激發(fā)后者產(chǎn)生熒光信號(hào)[14]。應(yīng)用該方法，他們從70 000多個(gè)小分子中篩選出了具有抑制CA蛋白活性的2-芳基喹唑啉類(lèi)化合物。該方法的優(yōu)點(diǎn)是高通量、無(wú)需固相檢測(cè)方法中的包被和洗板步驟、耗時(shí)短、靈敏度高，篩選得到的化合物結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)明確，能克服HTRF對(duì)于蛋白復(fù)合物尺寸的限制(相互作用復(fù)合物在200 nm范圍內(nèi)均可)。不足之處是設(shè)備和試劑成本高，不利于方法的推廣使用。反應(yīng)體系對(duì)于強(qiáng)光或者長(zhǎng)時(shí)間室內(nèi)光比較敏感。

Fig 4 Principle of AlphaScreen high-throughput assay based on CAI binding to CA CTD [14]

3.4細(xì)胞水平的篩選方法

3.4.1噬菌體展示 噬菌體展示是一項(xiàng)用于篩選多肽或抗體藥物的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。Sticht等[15]利用噬菌體展示技術(shù)建立了一種高通量的CA抑制劑篩選方法：分別將CA蛋白和C-CANC蛋白作為篩選靶蛋白，固定于甲苯磺?；揎椀拇胖楸砻妫捎檬氖删w展示庫(kù)篩選。結(jié)果篩選到一個(gè)能夠抑制CA組裝的12肽CAI (ITFEDLLDYYGP)。該方法的優(yōu)點(diǎn)價(jià)格低廉，不需要特殊儀器設(shè)備就能夠?qū)崿F(xiàn)，不足的地方是操作繁瑣，只能篩選到多肽抑制劑。盡管無(wú)法直接篩選到小分子抑制劑，但是從噬菌體多肽庫(kù)中篩選到的多肽抑制劑卻為后續(xù)設(shè)計(jì)小分子CA抑制劑提供了良好的理論基礎(chǔ)。

Fig 5 Principle of detection of CA CTD intermolecular interactions using BiFC assay [17]

3.4.3假病毒篩選 HIV-1假病毒篩選體系是一種基于單一復(fù)制周期HIV-1假病毒的藥物篩選方法，因安全性高，已被廣泛用于HIV-1的研究中[19]。Lamorte等[20]利用假病毒篩選體系，從600 000個(gè)結(jié)構(gòu)類(lèi)型豐富和復(fù)雜的化合物中，篩選到2個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的化合物BI-1和BI-2。Cao等[21]利用HIV-1假病毒篩選系統(tǒng)，從大于106個(gè)化合物中，篩選到1種具有新結(jié)構(gòu)的CA抑制劑PF-1385801，經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)改造得到了活性較好的候選化合物PF-3450074(PF74)。假病毒篩選方法的優(yōu)點(diǎn)顯而易見(jiàn)：免于接觸活病毒，無(wú)需BSL-3實(shí)驗(yàn)室，安全性高；適合高通量藥物篩選；宿主范圍廣，感染效率高。該技術(shù)的局限是：只能用于病毒復(fù)制早期階段的抑制劑篩選，無(wú)法用于病毒復(fù)制晚期的抑制劑篩選；無(wú)法全面體現(xiàn)病毒特性，因此在藥物篩選過(guò)程中可能更易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

3.5虛擬篩選分子生物學(xué)技術(shù)、X射線(xiàn)晶體學(xué)以及計(jì)算方法領(lǐng)域的不斷進(jìn)步，使得借助計(jì)算機(jī)技術(shù)和專(zhuān)業(yè)軟件進(jìn)行藥物篩選得以實(shí)現(xiàn)，這門(mén)技術(shù)被稱(chēng)作虛擬篩選。Tang等[22]利用虛擬篩選，以CA的NTD的β-發(fā)卡裂口為篩選界面，得到了1個(gè)靶向CA CTD的小分子化合物CAP-1，這也是首個(gè)CA的小分子抑制劑。Curreli等[23]針對(duì)CA CTD中的1個(gè)疏水凹槽(由第169～191位氨基酸殘基形成，是CAI 肽結(jié)合的 CTD 口袋)，對(duì)ZINC化合物庫(kù)中100 000個(gè)類(lèi)藥的分子進(jìn)行了虛擬篩選，從中得到了2個(gè)靶向CA CTD的小分子compound 6和compound 50。Kortagere等[24]使用基于藥效團(tuán)的虛擬篩選方法，結(jié)合PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的晶體數(shù)據(jù)(Protein Databank entry 3H4E)，篩選到了1個(gè)靶向CA蛋白N末端(CA NTD)的小分子抑制劑I-XW-053。與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)篩選相比，虛擬篩選優(yōu)勢(shì)在于高效、快速、經(jīng)濟(jì)，但該方法只能針對(duì)具有晶體結(jié)構(gòu)的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，限制了其在藥物篩選中的應(yīng)用。

4總結(jié)和展望藥物篩選的方法一般可歸為3類(lèi)：基于表型的藥物篩選、基于靶點(diǎn)的藥物篩選和基于結(jié)構(gòu)的藥物篩選[25]。目前發(fā)表的CA抑制劑篩選方法均屬于這3類(lèi)方法的范疇。在這些方法里面，除了虛擬的篩選方法外，其余方法全部是基于生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的篩選體系，未見(jiàn)基于生物物理方法建立的篩選體系。CA蛋白的組裝過(guò)程是蛋白-蛋白相互作用不斷發(fā)生和穩(wěn)定的過(guò)程，因此，CA蛋白抑制劑實(shí)際上就是一類(lèi)蛋白-蛋白相互作用抑制劑。蛋白-蛋白相互作用作用的界面面積較大(一般在1 000～6 000 ?2之間，傳統(tǒng)的藥物結(jié)合口袋面積一般小于1 000 ?2)，通常被認(rèn)為是無(wú)成藥性的靶點(diǎn)。因而，與HIV-1的3個(gè)酶(整合酶、蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶)相比，針對(duì)CA的小分子抑制劑研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。生物物理的方法(比如SPR、ITC、MST、NMR、BLI等)主要被用于分析生物分子之間的相互作用，尤其適用于蛋白-蛋白相互作用的藥物篩選，在未來(lái)應(yīng)該將生物物理的方法用于CA蛋白抑制劑的篩選中，以加快CA蛋白抑制劑的篩選進(jìn)程。另外，目前藥物篩選庫(kù)中的化合物大多符合類(lèi)藥五規(guī)則(rule of five)，這些分子的分子質(zhì)量一般小于500 u，難以實(shí)現(xiàn)阻斷蛋白-蛋白相互作用的任務(wù)。因此，在尋找CA抑制劑的過(guò)程中，必須打破類(lèi)藥五規(guī)則，突破常規(guī)，才能更快地尋找到相應(yīng)的抑制劑 。綜上所述，藥物篩選是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，選擇具有蛋白-蛋白抑制劑特點(diǎn)的小分子，將實(shí)驗(yàn)篩選(包括生物化學(xué)和生物物理的方法)和虛擬篩選相結(jié)合，將是今后CA抑制劑篩選的方向，有望篩選出用于臨床的CA抑制劑。