靈芝多糖結(jié)構(gòu)特征及藥理作用的研究進(jìn)展

王 穎， 魏佳韻， 吳思佳， 章春豪， 王興亞

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州311400）

靈芝為擔(dān)子菌綱多孔菌科真菌，為我國名貴傳統(tǒng)中藥材，應(yīng)用源遠(yuǎn)流長，是滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本的珍品，其藥用研究已有2 000多年的歷史，早期以研究靈芝子實體、菌絲體及孢子粉等有效成分及其結(jié)構(gòu)鑒定為主［1-3］。研究表明，靈芝主要活性物質(zhì)有多糖、三萜、甾醇、凝集素、蛋白質(zhì)等，其中靈芝多糖是其關(guān)鍵藥效成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成多樣，而結(jié)構(gòu)上的差異對其藥理作用具有一定的影響。隨著新技術(shù)發(fā)展，越來越多的研究深入關(guān)注靈芝多糖藥理活性，發(fā)現(xiàn)該成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、解毒、抗病毒、抗細(xì)菌、抗輻射等廣泛作用［4-5］。為近一步明確靈芝多糖藥理活性，許多研究在其活性作用分子機(jī)制方面開展了諸多積極的探索，同時也取得了一些有益的進(jìn)展，但近年來國內(nèi)外缺少對靈芝多糖相關(guān)研究較為全面的綜述報道。因此，本文對靈芝多糖結(jié)構(gòu)特征及藥理作用進(jìn)行綜述，在總結(jié)其研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上對未來研究方向提出展望。

1 組成結(jié)構(gòu)及其構(gòu)效關(guān)系

人們已從靈芝子實體、菌絲體、孢子粉、發(fā)酵液中提取分離出不同種類的多糖［6-8］，它們是由單一或多種單糖聚合而成的高分子化合物。由于靈芝的種類、產(chǎn)地、分離提取方法各異，靈芝多糖在化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成上有巨大的多樣性，結(jié)構(gòu)上細(xì)微差別可影響其特異性的生物功能，故完整描述其化學(xué)結(jié)構(gòu)對研究其生物活性至關(guān)重要。

1.1 組成結(jié)構(gòu) 通過熱水浸提法、乙醇沉淀法、Sevag法、色譜法等方法獲得的靈芝多糖主要由葡聚糖、糖蛋白、水溶性雜多糖組成［3］，其中各組分由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖、木糖和阿拉伯糖等單糖以不同比例、糖苷鍵、肽鍵結(jié)合［9-10］。

一般來說，多糖結(jié)構(gòu)特征包括分子量大小、單糖組成、糖苷鍵構(gòu)型、分支度、三級結(jié)構(gòu)等［5］，但產(chǎn)地、提取部位、分離提取方法不同，所得多糖組成也有所差異，如采用熱水浸提法提取同樣產(chǎn)自中國的靈芝子實體、菌絲體、孢子粉中多糖時發(fā)現(xiàn)，子實體中多糖是以β-糖苷鍵連接的、相對分子量0.6 kDa的雜聚糖，由鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖6種單糖構(gòu)成［11］；菌絲體含有的多糖是以α-D-Glc （1→6）， α-D-Glc， α-D-Man為主鏈的相對分子量為3.5 kDa的雜多糖，單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖［12-13］；孢子粉含有的多糖以β-（1→6）糖苷鍵連接的葡聚糖為主，相對分子量 103 kDa。Miyazaki等［14］也采用熱水浸提法提取產(chǎn)自日本的靈芝子實體中多糖， 發(fā)現(xiàn)其以 β-D-（1→3）、 β-D-（1→6）、（1→4） -α-、β-糖苷鍵相連的分枝雜聚糖為主，由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖組成，相對分子量40 kDa。此外，不同提取方法也是多糖結(jié)構(gòu)多樣性的重要原因，如產(chǎn)自中國的靈芝子實體經(jīng)堿抽提法得到的靈芝多糖是以β-1，3糖苷鍵連接的葡聚糖，相對分子量約4.0 kDa［15］。見表1。

表1 靈芝多糖結(jié)構(gòu)特征和生物活性

續(xù)表1

1.2 生物活性影響因素 由于產(chǎn)地、提取部位、提取方法等不同，靈芝多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)差異很大，對其生物活性具有很大影響，尤其是主鏈結(jié)構(gòu)。大量體外抗氧化試驗證實，從靈芝中分離提取出的同聚糖和雜聚糖具有顯著抗氧化活性［6，15］， 兩者主要糖苷鍵為 β- （1-3）、 （1-4）、 （1-6），Sone［1］、 Wang等［24］對多糖抗腫瘤活性與其結(jié)構(gòu)關(guān)系進(jìn)行了研究，均發(fā)現(xiàn)富含 （1→3）-β-D-葡聚糖主鏈結(jié)構(gòu)的多糖抗腫瘤活性最強(qiáng)， 但 Guo［21］、 Bao 等［23］發(fā)現(xiàn)富含由 β-或 β-D-（1→3）糖苷鍵連接而成的葡聚糖的多糖具有較好免疫調(diào)節(jié)作用。

多糖相對分子量也可影響生物活性，Ma等［7］研究表明分離組分 GLP1 （＞10 kDa）、 GLP2 （8～10 kDa）、 GLP3（2.5～8 kDa）、 GLP4 （＜2.5 kDa） 抗氧化活性和抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力與其分子量成正比。多糖生物活性還可能與其溶解度有關(guān)，Liu等［25］報道經(jīng)過羥丙基化改性后獲得了衍生物H-GLP，水溶性更高 （＞50 mg／mL），自由基清除活性也更強(qiáng)。Xu等［26］發(fā)現(xiàn)，甲基化修飾后多糖抗氧化活性較未修飾時顯著提高，表明化學(xué)基團(tuán)修飾也能影響其生物活性。另外，多糖生物活性還與黏度、分支度等有關(guān)［22］。具體見表1。

2 藥理作用

2.1 免疫調(diào)節(jié) Lin 等［27］研究了具有 （1→6） -β-D-葡聚糖分支結(jié)構(gòu)的靈芝多糖對人單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)多糖可能通過NF-κB、p38MAPK信號通路快速有效地誘導(dǎo)人樹突狀細(xì)胞的活化和成熟；另一項研究發(fā)現(xiàn)，從破壁靈芝孢子粉熱水提取物中分離純化的相對分子量512.5 kDa的多糖GL-BSP可顯著提高自然殺傷細(xì)胞 （NK細(xì)胞）活力，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用［28］。

靈芝多糖對細(xì)胞免疫功能的影響是其免疫調(diào)節(jié)作用的重要方面，也一直受到研究者的關(guān)注，Zhang等［16］利用細(xì)胞免疫-遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) （DTH）實驗研究了靈芝子實體水提物多糖的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)與對照組相比高劑量（2.25 g／kg） 組顯著提高足趾腫脹度 （P＜0.01）； 還有研究發(fā)現(xiàn)多糖可促進(jìn)S180荷瘤小鼠體內(nèi)脾淋巴細(xì)胞增殖，增加T淋巴細(xì)胞CD4＋、CD8＋比例［28］。此外，該成分還通過明顯增加抗體生成和增強(qiáng)血清中IFN-γ、TNF-α、NO水平，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)體液免疫和促進(jìn)免疫細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用［16，28-29］。

長期重負(fù)荷運(yùn)動能夠引起機(jī)體免疫應(yīng)答減弱。Shi等［30］研究了多糖對長期重負(fù)荷運(yùn)動小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)它可顯著增加外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞絕對值、巨噬細(xì)胞吞噬活性、血清凝集效價及空斑形成細(xì)胞數(shù)量，改善非特異性和特異性免疫應(yīng)答。

綜上所述，靈芝多糖通過激活樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化及成熟，誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞，調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞的增殖與免疫應(yīng)答、促進(jìn)免疫細(xì)胞因子生成，用于發(fā)揮提高機(jī)體非特異性和特異性免疫的作用［31］。

2.2 抗腫瘤 靈芝多糖的抗腫瘤作用最初是在小鼠S-180肉瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的［1，14］。除了動物、細(xì)胞模型實驗外，靈芝多糖也被用于臨床抗腫瘤治療，該活性與激活宿主免疫調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)［32-33］。

2.2.1 動物、細(xì)胞模型實驗 在體內(nèi)動物模型中，多糖已經(jīng)顯示出通過增強(qiáng)免疫而抑制腫瘤發(fā)展的作用［34-37］。Sun等［38］從靈芝熱水提取物中分離出一種以β-糖苷鍵連接的相對分子量584.9 kDa的雜多糖，可通過增加B16F10黑色素瘤細(xì)胞表面H-2Db（MHCⅠ類抗原）和B7-1、B7-2（協(xié)同刺激分子）表達(dá)來促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化與增殖及IFN-γ的分泌，進(jìn)而抑制B16F10細(xì)胞生長。從破壁靈芝孢子粉中分離純化的多糖GL-BSP （50、100和200 mg／kg） 可通過刺激NK細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活機(jī)體免疫應(yīng)答，抑制BALB／c小鼠中S180肉瘤的生長［28］。另外，在肝癌荷瘤小鼠中，靈芝多糖通過增大效應(yīng)T細(xì)胞／調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對效應(yīng)T細(xì)胞增殖的抑制及增加IL-2的分泌而明顯抑制腫瘤生長［39］。

Liang等［36］在研究水溶性靈芝多糖 （α-糖苷鍵連接）對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的作用時發(fā)現(xiàn)，它可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡，并與線粒體、MAPK信號通路密切相關(guān)。Yang等［40］報道，靈芝多糖可通過激活P38、JNK／MAPK途徑誘導(dǎo)HL-60急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞周期阻滯和凋亡。課題組最新研究顯示，破壁靈芝孢子粉中提取的多糖能以時間、劑量依賴方式抑制HCT116細(xì)胞增殖，將細(xì)胞周期阻滯在G2／M期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［41］；可顯著抑制裸鼠HCT116移植瘤發(fā)生發(fā)展，并緩解5-氟尿嘧啶所引起的小鼠體質(zhì)量明顯降低；水提物抗腫瘤作用可能與激活促凋亡基因NAG-1有關(guān)［41］。

2.2.2 臨床應(yīng)用 近年來，腫瘤免疫治療取得了顯著成績，但治療方案不成熟，而且其發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性使得單用該方法并不能達(dá)到理想的抗癌效果，研究表明，免疫治療輔助化療可獲得較好的效果［42］。一項由373名癌癥患者組成的5個隨機(jī)對照試驗Meta分析顯示，靈芝可顯著增加外周血CD3、CD4、CD8水平，提高白細(xì)胞、NK細(xì)胞活性及CD4／CD8比值，從而使化療／放療效果更好，生活質(zhì)量也相對提高［43］。 Gao等［44］研究了 Ganopoly （靈芝多糖提取物）對晚期癌癥患者的作用，34名晚期癌癥患者只接受1 800 mg劑量治療12周，每天3次，發(fā)現(xiàn)它可顯著增加血清IL-2、IL-6、IFN-γ平均濃度及自然殺傷細(xì)胞活性，并顯著提高CD56＋細(xì)胞的絕對數(shù)量及患者PHA反應(yīng)。最近，Sun等［45］考察了多糖對肺癌患者的治療作用，發(fā)現(xiàn)它可拮抗肺癌患者血漿對淋巴細(xì)胞的增殖和活化的抑制作用。具體見圖1。

圖1 靈芝多糖抗腫瘤作用的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

2.3 抗氧化 生物體在代謝過程中會產(chǎn)生各種氧自由基，而過多自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)會導(dǎo)致器官組織損傷，并與機(jī)體衰老、炎癥和心腦血管疾病等病理過程密切相關(guān)，許多中藥多糖都具有抗氧化活性［46-48］。體外試驗顯示，靈芝多糖可有效清除羥自由基、DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化物的生成［8，49］；體內(nèi)試驗中， Li等［11］、 Zhao 等［50］分別以 γ-射線、 運(yùn)動誘導(dǎo)氧化應(yīng)激小鼠模型，發(fā)現(xiàn)多糖呈劑量依賴性增加SOD、CAT、GSH-Px活性，并顯著降低MDA水平。

另外，靈芝多糖還具有抗衰老作用。Li等［51］觀察了多糖對D-氨基半乳糖致衰老小鼠的作用，發(fā)現(xiàn)它通過提高皮膚組織SOD水平增加表皮和真皮厚度，改善皮膚組織結(jié)構(gòu)來延緩皮膚衰老。多糖GL-PS（純度98%）可通過消除中波紫外線UVB誘導(dǎo)的活性氧ROS，保護(hù)人皮膚成纖維細(xì)胞抵抗光老化［52］。

2.4 降血糖及抗糖尿病及其并發(fā)癥 研究表明，中藥多糖具有較好的降血糖功效，并且作用溫和，無毒副作用，具有巨大開發(fā)潛能［53-56］。靈芝多糖在控制血糖、提高胰島素敏感性、增強(qiáng)胰島β細(xì)胞功能、改善糖尿病并發(fā)癥方面有較好的效果，Hikino等［57］最早研究發(fā)現(xiàn)它可提高小鼠血漿胰島素水平，降低血漿糖水平，隨后被證明是通過調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)酶活性、抗氧化和降低β細(xì)胞凋亡等控制血糖濃度［58-60］。最近研究發(fā)現(xiàn)，它還可能通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子及腸道菌群組成來改善小鼠的胰島素敏感性［61-62］。具體見表2。

臨床上關(guān)于靈芝多糖治療胰島素抵抗和糖尿病的報道較少，Gao等［73］研究了多糖提取物 （商品名ganopoly）對71名2型糖尿病患者的治療效果，發(fā)現(xiàn)1 800 mg劑量（每日3次，口服）治療12周后與安慰劑相比，能更顯著降低患者空腹和餐后糖化血紅蛋白、血糖水平，特別是餐后血糖由服藥前的 13.6 mmol／L 降至 11.8 mmol／L （P＜0.05），而且空腹和餐后2 h胰島素顯著升高。

表2 靈芝多糖降血糖及抗糖尿病功效

綜上所述，靈芝多糖在動物模型、臨床試驗中均顯示出較好的抗糖尿病作用，機(jī)制見圖2。但動物模型單一，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型為主，缺乏體外細(xì)胞模型及臨床研究，故今后還需要進(jìn)一步揭示該成分調(diào)控糖代謝和胰島素抵抗的具體分子機(jī)制。

圖2 靈芝多糖抗糖尿病機(jī)制

2.5 抗炎 在體外細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖 （5、10、20、 50、 100 μg／mL） 處理RAW264.7細(xì)胞后， 可呈劑量依賴性地降低促炎因子iNOS、IL-1、TNF-α的表達(dá)，而抗炎因子IL-10水平明顯增加，是通過抑制 NF-κB、JNK1／2、P38MAPKs活性實現(xiàn)的［74］。在脂多糖刺激的人主動脈平滑肌細(xì)胞中，靈芝多糖 （10 μg／mL） 通過抑制ERK磷酸化、NF-κB活性、TLR4信號通路明顯降低IL-1β表達(dá)。動物實驗亦表明，每天口服60 mg／kg靈芝多糖可降低小鼠胸主動脈中IL-1β表達(dá)［75］。最近研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖GLPss58能明顯抑制L-選擇素與其配體結(jié)合，而白細(xì)胞炎癥反應(yīng)的第一步就是兩者結(jié)合，這對抑制炎癥反應(yīng)有重要意義［76］。

2.6 抗菌 靈芝多糖可抑制細(xì)菌生長或直接殺死致病菌［77］， 但相關(guān)報道較少。 Bai等［78］通過紙片瓊脂法對提取出的粗多糖進(jìn)行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)它對植物病原菌中的胡蘿卜歐氏菌、指狀青霉菌的抑菌圈直徑分別為8、6 mm，而對灰葡萄孢幾乎無抑制作用；食品有害菌中的枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌也被模型抑制，抑菌圈直徑分別為11.7、18.3 mm，但對大腸桿菌作用相對較弱，對黑曲霉和黑根霉幾乎無作用。隨后，Mahendran等［79］也發(fā)現(xiàn)多糖EPS能明顯抑制蠟狀芽孢桿菌的生長。

2.7 其他 Zhang等［80］研究了提取自靈芝菌絲體中的多糖對卡介菌BCG誘導(dǎo)的免疫性肝損傷小鼠的作用，發(fā)現(xiàn)它可明顯改善肝腫大，減少ALT釋放及NO產(chǎn)生，有著肝保護(hù)作用。在132名神經(jīng)衰弱患者組成的隨機(jī)雙盲對照試驗中發(fā)現(xiàn)，多糖提取物Ganopoly（1 800 mg，每日3次，療程8周）可改善臨床癥狀，臨床整體印象嚴(yán)重度、疲勞感得分分別較基礎(chǔ)值降低15.5%、28.3%，健康狀況評分提高38.7%［81］。 Ouyang 等［82］研究發(fā)現(xiàn)， 靈芝粗多糖 （100～200 mg／kg）處理后化療相關(guān)性疲勞小鼠血肌酐和尿素氮降低，可能通過減少腎毒素來改善癥狀。Zhao等［83］發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可減少鈷60-γ射線輻射小鼠DNA單鍵斷裂和微核頻率，提高防輻射作用。同時，靈芝多糖還可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)［84］。

3 展望

近幾十年來，國內(nèi)外對靈芝多糖提取分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定、藥理作用、保健功能等方面進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)該成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖和抗糖尿病、抗炎、抗菌等多種藥理活性，在藥用資源、治療佐劑、保健食品添加劑方面具有巨大開發(fā)前途。但靈芝多糖組成結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及分離分析方法的限制，其種類、分子結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系、作用機(jī)制、最佳給藥劑量和途徑也仍未完全明確，臨床相關(guān)研究也十分缺乏。因此，進(jìn)一步探明靈芝多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)，深入研究其藥理活性，尋找其物質(zhì)基礎(chǔ)、抗病機(jī)制及潛在保健藥物功能，仍是今后研究的基礎(chǔ)。同時，利用3D技術(shù)等新興技術(shù)，對靈芝多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾以增強(qiáng)其免疫和抑癌活性，提高臨床應(yīng)用也是重要研究方向。

研究表明，靈芝孢子粉有效成分含有量及藥用價值遠(yuǎn)高于靈芝其他部位［85-86］，破壁后更明顯［87-88］，故研究去壁或破壁靈芝孢子粉多糖的生理功能也是今后一個重要的研究點(diǎn)。隨著人們健康意識的逐步提高，以靈芝多糖為主要成分的保健品和藥品具有廣闊的發(fā)展空間和巨大的商業(yè)價值，相信隨著對該成分藥理活性及構(gòu)效關(guān)系的深入研究，靈芝作為擁有數(shù)千年藥用歷史的傳統(tǒng)珍貴中藥材必將在抗衰老、抗癌癥等方面作出更大貢獻(xiàn)。