基于SPME-GC-MS與PCA的不同萃取頭萃取刺梨汁香氣成分效果比較

顧苑婷 彭邦遠 丁筑紅

(貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)薔薇科薔薇屬落葉灌木，富含多種功能性成分，如VC、超氧化物歧化酶、刺梨黃酮、刺梨多糖等，具有較高營養(yǎng)價值的藥食兩用植物[1]。刺梨具有令人愉快的清香優(yōu)雅香氣，其果汁風(fēng)味物質(zhì)組成復(fù)雜，同時包含滋味物質(zhì)和氣味物質(zhì)，揮發(fā)性香氣物質(zhì)不穩(wěn)定、易揮發(fā)、含量低，在萃取過程中容易發(fā)生各種物理化學(xué)反應(yīng)，因此，在固定的萃取技術(shù)方法上選擇合適的萃取條件十分重要。據(jù)文獻[2-5]報道，提取揮發(fā)性物質(zhì)的方法有水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法、同時蒸餾法、靜態(tài)頂空萃取法等，但這些方法都存在一些不足，如萃取所需有機溶劑有毒且污染環(huán)境；靜態(tài)頂空萃取樣品蒸氣體積過大，影響色譜柱的分離效能。固相微萃取技術(shù)(Solid Phase Micro-extraction，SPME)是一種樣品預(yù)處理技術(shù)，集取樣、萃取、濃縮和進樣為一體，因操作簡單，樣品用量少，無需使用溶劑等特點被廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味研究[6-8]。SPME的核心部件是吸附揮發(fā)物質(zhì)的纖維頭，不同種類涂層纖維頭性能不同，對不同香氣揮發(fā)物質(zhì)的萃取效果影響很大，為萃取頭選擇合適的涂層纖維是進行樣品揮發(fā)性關(guān)鍵物質(zhì)分析的首要條件[9]。近年，研究者[10-13]利用頂空固相微萃取法對香氣成分進行研究，刺梨汁因風(fēng)味物質(zhì)組成復(fù)雜，不同萃取頭對化合物選擇性不同，結(jié)果有較大差異。因此，在固定的萃取技術(shù)方法上選擇合適的萃取條件對客觀準確檢測刺梨汁香氣物質(zhì)十分重要。目前報道[14]多以揮發(fā)性物質(zhì)的靈敏度及關(guān)鍵共有香氣物質(zhì)含量作為評選最優(yōu)萃取頭的依據(jù)。本研究擬采用常用的4種固相萃取纖維對刺梨汁香氣成分進行富集比較，以檢出的化合物種類含量及靈敏度作為選擇萃取頭的依據(jù)，結(jié)合主成分分析，建立刺梨汁香氣品質(zhì)評級模型，探討刺梨汁固相微萃取的萃取條件，為后續(xù)刺梨汁香氣物質(zhì)的分析提供科學(xué)準確的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨：貴農(nóng)5號品種，貴州龍里，成熟新鮮無霉爛變質(zhì)；

氯化鈉：分析純，江川化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

手動固相微萃取裝置：Z118877型，美國Supelco公司；

萃取頭：100 μm PDMS(聚二甲基硅氧烷)、75 μm CAR/PDMS(碳分子篩-聚二甲基硅氧烷)、50/30 μm DVB/CAR/PDMS(二乙烯基笨-碳分子篩-聚二甲基硅氧烷)、65 μm PDMS/DVB(聚二甲基硅氧烷-二乙烯基笨)，美國Supelco公司；

榨汁機：ZZ102型，順科電器有限公司；

GC/MS聯(lián)用儀：HP6890/5975C型，美國Agilent公司；

色譜柱：HP6890/5975CHP-5MS(5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane=30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，美國Agilent公司；

電子天平：CP114型，奧豪斯儀器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：HJ-3型，釜壇市中大儀器廠；

水浴鍋：SB-2000 EYELA型，愛朗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備 經(jīng)挑選的刺梨去蒂、清洗、破碎、榨汁，所得果汁經(jīng)4層紗布過濾，備用。

1.3.2 萃取頭的老化 將首次使用的萃取頭(100 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB)在氣相色譜進樣口老化至無雜峰，老化溫度及老化時間參考表1。

表1 萃取纖維操作參數(shù)[15]Table 1 Instruction for SPME fibers

1.3.3 萃取頭的選擇 取5 mL刺梨汁，1.8 g NaCl于裝有磁力攪拌轉(zhuǎn)子的10 mL頂空瓶內(nèi)，立即用PTFE/硅橡膠隔墊密封，于40 ℃磁力攪拌器上攪拌30 min，將經(jīng)老化的4種萃取頭在固定的萃取條件下分別穿過頂空瓶密封墊，插入深度1 cm，50 ℃吸附20 min后，將萃取頭立即插入GC中解吸5 min，解析溫度250 ℃，同時啟動氣質(zhì)聯(lián)用儀進行分析，重復(fù)2次。

1.3.4 不同萃取頭萃取化合物靈敏度的比較 使用累積峰面積標準化值[16](Cumulative area normalization value，CANV)對刺梨汁揮發(fā)性化合物的萃取靈敏度進行評價，具體計算公式：

Avk=

(1)

(2)

(3)

式中：

Avk——4種不同的萃取纖維頭萃取化合物k時的峰面積的平均值；

Ak(x)——x萃取纖維頭萃取化合物k時所得峰面積的絕對值，x為文中所探討的4種萃取頭(100 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB)中的任意一種：

NAk(x)——x萃取纖維萃取化合物k的峰面積標準化值；

CANVk(x)——x萃取頭萃取n個化合物累積峰面積標準化值。

相同的保留時間內(nèi)不同萃取纖維頭對同一化合物的萃取也不相同，同一保留時間下，若相同化合物的累積標準化值越大，則認為該萃取纖維頭對此化合物的萃取效果越好，靈敏度越高[17]。

1.3.5 GC-MS檢測條件及定性定量分析

(1) GC條件：色譜柱HP6890/5975CHP-5MS彈性石英毛細管柱，柱溫45 ℃(保留2 min)，以4 ℃/min升溫至220 ℃，保持2 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓52.54 kPa，載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間1.5 min[11]。

(2) MS條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 615 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍20～450 amu[11]。

將檢測到的質(zhì)譜信息與NIST和Wiley質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中已知化合物數(shù)據(jù)進行匹配，根據(jù)匹配度>70%原則對鑒定化合物進行選取，并且配合手動檢索校對進行定性，結(jié)合相關(guān)文獻資料，初步確認不同萃取頭萃取刺梨汁的香氣物質(zhì)；采用峰面積歸一法對揮發(fā)性成分的含量進行計算。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0進行主成分分析與相關(guān)統(tǒng)計分析，采用Excel 2010進行繪圖制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同萃取纖維萃取揮發(fā)性物質(zhì)離子流圖分析

4種固相微萃取纖維萃取頭對刺梨汁萃取效果離子流圖見1～4。

由圖1～4可以看出，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維對刺梨汁香氣的萃取效果明顯優(yōu)于其他3種，對同一樣品最大吸附量的數(shù)量最多，其原因為50/30 μm DVB/CAR/PDMS兼具DVB涂層、CAR涂層和PDMS涂層的優(yōu)點，其對低沸點物質(zhì)的萃取靈敏度優(yōu)于高沸點物質(zhì)[18]，可吸附揮發(fā)性及半揮發(fā)性物質(zhì)[19]。65 μm PDMS/DVB涂層在保留時間20 min之前萃取的物質(zhì)峰均勻尖銳，具有較好的萃取效果，20 min之后萃取出少量物質(zhì)且峰面積極少，其主要吸附極性揮發(fā)物質(zhì)[20]，選擇性吸附的范圍較50/30 μm DVB/CAR/PDMS涂層萃取頭窄，因此吸附量相對較少。100 μm PDMS涂層萃取頭主要吸附非極性揮發(fā)物[21]，檢測到的物質(zhì)含量低，種類少，峰形小，保留時間靠前和靠后的一些物質(zhì)未能檢測出。75 μm CAR/PDMS涂層萃取頭檢測到的物質(zhì)保留時間靠前，峰形較小且連帶峰嚴重，此萃取頭對刺梨汁揮發(fā)性物質(zhì)的分離效果較差?？梢?，50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維涂層萃取頭對刺梨汁揮發(fā)性物質(zhì)的萃取效果總體上優(yōu)于其他3種萃取頭，對選擇性不高的化合物具有較低的檢測限，可以較為全面反映刺梨汁中的揮發(fā)性成分。

圖1 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取刺梨汁香氣總離子流圖

Figure 1 50/30 μm DVB/CAR/PDMS extraction of Total Ion flow Diagram ofRosaroxburghiitratt Juice

圖2 65 μm PDMS/DVB萃取刺梨汁香氣總離子流圖

Figure 2 65 μm PDMS/DVB extraction of Total Ion flow Diagram for aroma ofRosaroxburghiitratt Juice

圖3 100 μm PDMS 萃取刺梨汁香氣總離子流圖

Figure 3 100 μm PDMS extraction of Total Ion flow Diagram for aroma ofRosaroxburghiitratt Juice

圖4 75 μm CAR/PDMS萃取刺梨汁香氣總離子流圖

Figure 4 75 μm CAR/PDMS extraction of Total Ion flow Diagram for aroma ofRosaroxburghiitratt Juice

2.2 不同萃取頭萃取揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量與含量比較

分析4種萃取頭萃取的刺梨汁揮發(fā)性成分SPME-GC-MS數(shù)據(jù)見圖5、6。結(jié)果說明不同萃取頭對刺梨汁的揮發(fā)性物質(zhì)吸附能力有很大差異，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭檢測揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積為6.941 3×108，總相對含量為93.96%，75 μm CAR/PDMS的總峰面積為5.352 5×108，總相對含量為92.08%，65 μm PDMS/DVB的總峰面積為3.129 9×108，總相對含量為91.19%，100 μm PDMS的總峰面積為4.577 0×107，總相對含量為92.79%。

通過對4種萃取纖維所萃取物質(zhì)的數(shù)量、相對含量進行比較分析，可以看出，刺梨香氣中含量較高的香氣種類依次為酯類、醇類和酮類物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)數(shù)量明顯高于其他物質(zhì)。由圖5、6可知，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取出的酯類種類最多(17種)，其次是65 μm PDMS/DVB(11種)、75 μm CAR/PDMS(9種)，100 μm PDMS(5種)最少，而從萃取量比較，75 μm CAR/PDMS(68.62%)>50/30 μm DVB/CAR/PDMS(46.37%)>100 μm PDMS(32.71%)>65 μm PDMS/DVB(31.35%)。酯賦予果實花香味[22]，呈現(xiàn)出令人愉悅的果香[23]；乙酸乙酯具有果香[24]、醚香、菠蘿香、葡萄香和櫻桃香[25]；乙酸丙酯含量雖低，但能起到協(xié)調(diào)香味的作用，賦予刺梨特殊的感官特性，構(gòu)成刺梨的重要香氣特征。50/30 μm DVB/CAR/PDMS檢測出4種獨有物質(zhì)，為異戊酸乙酯、2-羥基異戊酸乙酯、乙酸庚酯、己二酸二異辛酯，且異戊酸乙酯含量較高，帶有飄逸的果香。75 μm CAR/PDMS檢測出乙酸乙酯含量(65.17%)遠高于50/30 μm DVB/CAR/PDMS(25.62%)，表現(xiàn)出對乙酸乙酯較高敏感性。綜合萃取種類考慮，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取酯類成分能力優(yōu)于其他3種。

圖5 4種萃取頭萃取刺梨汁香氣成分相對含量比較

Figure 5 Comparison of relative contents of aroma components inRosaroxburghiiJuice by four kinds of extraction head

Figure 6 Comparison of aroma components inRosaroxburghiiJuice by four kinds of extraction head

50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取的醇種類最多，含量僅次于75 μm CAR/PDMS，且以高級醇為主。醇類通常具有花香味和果味，可平衡刺梨的味道。其中葉醇含量最高，具青草香與茶香[26]，1-辛烯-3-醇帶有青草香、水果香、塵土風(fēng)味[27]。50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取的酮類物質(zhì)種類較多，含量較高，2-庚酮含有類似梨的香氣[28]。萜烯類50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取出的數(shù)量最多，萜烯類表征果實香氣，羅勒烯具有花香與青草香，石竹烯具有溫和的丁香味。張丹等[12]研究認為烯烴類化合物是刺梨重要的呈香物質(zhì)。綜上可以看出，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取效果最好。

2.3 不同萃取頭靈敏度的比較

圖7～12顯示了不同萃取頭對刺梨各類揮發(fā)性化合物的靈敏度。

Tat等[29]認為不同萃取頭對樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進行萃取時，累積揮發(fā)性物質(zhì)峰面積越大則表明萃取頭的靈敏度越高，靈敏度的高低可能與峰的分離效果有關(guān)。

圖7 不同萃取頭酯類累積標準化值Figure 7 CANV of esters by different fibers

50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取酯類、醇類、烴類、萜烯類、醛酮醚類、呋喃及其他類具有最大的CANV值，萃取靈敏度高。65 μm PDMS/DVB萃取酯類、醇類、烴類、萜烯類的CANV值呈先增大后平穩(wěn)再減少趨勢，增減波動幅度較小，萃取其他物質(zhì)的CANV值比較穩(wěn)定；75 μm CAR/PDMS萃取刺梨汁揮發(fā)性成分的CANV值平穩(wěn)而居中，萃取效果不明顯；100 μm PDMS萃取頭萃取刺梨汁揮發(fā)性成分的CANV值最小，說明100 μm PDMS萃取頭萃取刺梨汁揮發(fā)性成分的萃取靈敏度不高，萃取效果總體較差，不適合刺梨汁香氣成分的富集與萃取。結(jié)合圖5、6分析，刺梨汁揮發(fā)性風(fēng)味化合物的主要成分為酯類、醇類、酮類、酸類和少量萜烯類物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)的相對含量占比最高，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取主要香氣成分的總峰面積最大，檢出物總相對含量最高，對酯類，醇類，酮類等物質(zhì)的萃取靈敏度最高。因此，50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維最適用于刺梨汁香氣成分的萃取分析。

圖9 不同萃取頭烴類累積標準化值Figure 9 CANV of alkanes by different fibers

圖10 不同萃取頭萜烯類累積標準化值Figure 10 CANV of terpenes by different fibers

圖11 不同萃取頭醛酮醚類累積標準化值Figure 11 CANV of aldehydes、ketones and aethers by different fibers

圖12 不同萃取頭呋喃類與其他累積標準化值Figure 12 CANV of furanes and others by different fibers

2.4 不同萃取頭檢出物PCA分析及風(fēng)味品質(zhì)評價模型

利用SPSS 17.0軟件對4種萃取頭所萃取刺梨汁揮發(fā)性香氣成分含量進行主成分分析，選取特征值>1 的成分為主成分。由表2 可知，有2個主成分，且累計貢獻率96.010%，這2個主成分能夠充分解釋刺梨汁揮發(fā)性香氣大部分信息。

從表2、3可以看出：第1主成分的方差貢獻率為70.816%，反映的主要是酯類、醇類、酸類和醚類4種風(fēng)味成分的變異信息，第1主成分與酯類、醇類和醚類風(fēng)味物質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系，與酸類呈負相關(guān)關(guān)系；第2主成分的方差貢獻率為 25.195%，反映的主要是醛類、酮類和呋喃類化合物3種風(fēng)味成分的變異信息，第2主成分與呋喃類化合物呈正相關(guān)，與酮類和酮類呈負相關(guān)關(guān)系。

表2 2個主成分的特征值及其貢獻率Table 2 Eigenvalues and contribution rate of the two principal components

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Principal component eigenvectors and loading matrix

以F1(第1主成分的得分值)和F2(第2主成分的得分值)2個成分來代表原來的10類風(fēng)味成分所表達的信息，建立刺梨汁揮發(fā)性風(fēng)味成分的評價模型，得出線性關(guān)系式：

F1=0.189X1+0.058X2+0.200X3+0.033X4-0.167X5-0.113X6-0.247X7+0.091X8+0.145X9-0.123X10，

(4)

F2=-0.039X1+0.145X2-0.069X3-0.245X4+0.003X5+0.301X6+0.206X7-0.293X8+0.028X9-0.069X10。

(5)

F1和F2的得分值越大，表明萃取頭萃取效果越好。利用SPSS軟件，得到綜合風(fēng)味品質(zhì)的評價函數(shù)F的表達式為：F=0.708 2F1+0.252 0F2。根據(jù)所得風(fēng)味評價綜合得分值排序得表4。

風(fēng)味評價模型的得分愈高，刺梨汁香氣愈佳，萃取纖維萃取效果愈好[2]。由表4可知，綜合得分(F)最高分為75 μm CAR/PDMS萃取頭萃取的刺梨汁風(fēng)味物質(zhì)，其次是50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭所萃取的，由于75 μm CAR/PDMS萃取頭單一萃取乙酸乙酯含量最高，且乙酸乙酯對刺梨風(fēng)味貢獻較大，占比較高，導(dǎo)致綜合分值偏高。根據(jù)風(fēng)味品質(zhì)的綜合評價模型，以第1主成分值為橫坐標，第2主成分值為縱坐標作分散點圖，由圖13可知，4個萃取頭主成分值距離較遠，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭分布在第1主成分與第2主成分的正半軸，75 μm CAR/PDMS萃取頭分布在第1主成分的正半軸，第2組成分的負半軸。綜合評價，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭是萃取刺梨汁最佳選擇。

表4 標準化后主要成分綜合得分Table 4 The composite scores table of principal components after standardization

圖13 4種萃取頭第1主成分和第2主成分得分散點圖

Figure 13 Scores of the first principal component and the second group of four extractors

3 結(jié)論

(1) 通過GC-MS分析，比較4種萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、100 μm PDMS)萃取刺梨汁香氣成分化合物的數(shù)量、總峰面積及總相對含量，得出50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭檢出物的種類及相對含量較優(yōu)。通過萃取頭靈敏度檢驗發(fā)現(xiàn)，50/30 μm DVB/CAR/PDMS CANV值最大，萃取靈敏度高。

(2) 采用主成分分析對刺梨香氣成分綜合評價可知，酯類、醇類、酸類和醚類物是影響刺梨汁風(fēng)味香氣成分的主要因素。根據(jù)建立的風(fēng)味評價模型，計算出不同萃取纖維萃取刺梨汁風(fēng)味得分綜合分析評價，得出50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭為刺梨汁揮發(fā)性物質(zhì)分析的最佳萃取頭。

本試驗對刺梨果汁香氣物質(zhì)萃取條件進行了探索，有關(guān)不同貯藏與水解條件對刺梨汁香氣釋放與釋放機理有待進一步深入研究。