PP2A對(duì)乳腺癌干細(xì)胞增殖、分化的影響

唐 煒*，張曉申，高 進(jìn)，陳 倫，鄭文博

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科，廣東 廣州 510120）

在我國(guó)沿海城市，乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，已躍居為女性惡性腫瘤第一位[1]。引起乳腺癌轉(zhuǎn)移和治療抵抗的一個(gè)重要原因是存在著乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells)。目前認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞自我更新增殖以及高度致瘤能力特征，是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵原因[2]。

近年研究發(fā)現(xiàn)了許多腫瘤干細(xì)胞維持自我更新和多向分化能力的信號(hào)通路，如Wnt、Notch、Hedgehog和Bmi等［3,4］。已知由蛋白磷酸酶2A調(diào)控激酶或關(guān)鍵分子的去磷酸化在調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的“干性”中起重要作用。Neviani等人發(fā)現(xiàn)PP2A在慢性髓系白細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞中低表達(dá)，使用 PP2A 的活化藥物可降低處于靜止期的腫瘤干細(xì)胞生存和自我更新能力[5]。本研究擬通過(guò)檢測(cè)人乳腺癌中PP2A的表達(dá)情況，研究其表達(dá)對(duì)乳腺癌干細(xì)胞增殖和分化的影響，進(jìn)一步闡明PP2A在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2011年8月～2015年3月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科接受手術(shù)治療的159例乳腺癌患者（均為女性）。年齡32～79歲，平均52歲。本試驗(yàn)所有入選乳腺癌組織標(biāo)本的收集均征得患者同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞

lentilox pll3.7，pCMV-VSV-G，pHR’8.9_VPR和大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)菌由本實(shí)驗(yàn)室保存及構(gòu)建。本實(shí)驗(yàn)所使用的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7和HEK-293T細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.2.2 試劑

Trizol（Invitrogen，美國(guó)），PrimeScript RT reagent kit（TAKARA，日本），B27 （Invitrogen，美國(guó)），牛血清白蛋白（Sigma，美國(guó)），lipofectamine 2000（Invitrogen，美國(guó)），anti-Sox2抗體（Abcam，美國(guó)），anti-Oct4抗體（Abcam，美國(guó)）,氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、DEPC均購(gòu)于廣州威佳公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)PP2A表達(dá)量

PP2A以及GAPDH引物序列如下：

PP2A：

5’-AAGAGAGAGGAGGAGAGGGA-3’，

5’-GCCAGGAGGACCTCATCTTC-3’，

GAPDH：

5’-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3’，

5’-GGGTGGAATACATTGGAACATGT-3’。

每個(gè)檢測(cè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，在LightCycler480 Realtime PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，最終得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和PP2A/GAPDH的相對(duì)值。

1.3.2 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

挑選已證實(shí)有生物學(xué)作用的si-PP2A序列經(jīng)T4 DNA連接酶連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化E.coli DH5感受態(tài)細(xì)菌，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定，得到載體lenti-PP2A-shRNA。將載體和輔助病毒載體轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞，收集病毒液后感染MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀分選系統(tǒng)分選GFP陽(yáng)性的細(xì)胞，即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

1.3.3 球囊形成實(shí)驗(yàn)

將MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞消化后，用球囊培養(yǎng)基在低粘附96孔板中培養(yǎng)，每孔1000個(gè)細(xì)胞，生長(zhǎng)7天后數(shù)球囊個(gè)數(shù)。

1.3.4 Western-blotting

提取細(xì)胞總蛋白。制備電泳SDS凝膠后，每個(gè)泳道加入10～50 ug的提取蛋白，電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，洗膜，孵育一抗，洗膜，用連接辣根過(guò)氧化酶的對(duì)應(yīng)的IgG二抗孵育?？乖贵w結(jié)合用化學(xué)發(fā)光劑觀測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌中PP2A的表達(dá)

使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)159例乳腺癌患者組織檢測(cè)其PP2A的含量，在患者腫瘤組織中，PP2A的表達(dá)（0.650±0.296）低于癌旁組織（4.786±2.838）（圖1）。t檢驗(yàn)得出；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 PP2A在乳腺癌組織和癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量， *：P＜0.01。

2.2 PP2A表達(dá)降低對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞球囊形成率的影響

在MDA-MB-231細(xì)胞中，mock和sh-GFP組的球囊形成率分別為：6.67±0.58和6.33±1.53個(gè)，在PP2A低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株中，球囊形成率分別為26.67±2.52和30.33±6.11個(gè)。在MCF-7細(xì)胞株中，四組的球囊形成率分別為5±1.73、5.67±2.52、23.33±2.52和22.33±5.69。表明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中，PP2A降低能升高乳腺癌干細(xì)胞的球囊形成率，即提高了乳腺癌干細(xì)胞的增殖能力；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 sh-PP2A穩(wěn)轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞株的球囊形成率。

2.3 PP2A對(duì)乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物的影響

我們使用Western blotting檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Sox2和Oct4這兩個(gè)乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)穩(wěn)轉(zhuǎn)株中，Sox 2和Oct4的蛋白表達(dá)升高，表明PP2A的低表達(dá)維持了乳腺癌干細(xì)胞的“干性”，降低了干細(xì)胞的分化能力。

3 討 論

蛋白磷酸酶是具有催化已經(jīng)磷酸化的蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類(lèi)酶分子，與蛋白激酶相對(duì)應(yīng)存在，通過(guò)去磷酸化在細(xì)胞特定的時(shí)相調(diào)控蛋白質(zhì)的活性和信號(hào)通路的激活獲抑制。而PP2A是真核生物中最主要的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶[6]。PP2A核心酶（A和C亞基）與不同的調(diào)節(jié)B亞基形成功能特異的全酶－三聚體復(fù)合物，目前至少存在75種由不同亞基組合形成的PP2A全酶，因此PP2A核心酶的異常表達(dá)或調(diào)控亞基B的功能缺失會(huì)引起特異的信號(hào)通路的功能紊亂[7]。迄今，大量研究證實(shí)PP2A在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄等方面的調(diào)控起重要作用。PP2A還與TOR通路、ERK通路以及Wnt信號(hào)通路均有關(guān)。

有關(guān)PP2A在腫瘤生長(zhǎng)和遷移的作用已經(jīng)有報(bào)道。在小鼠為模型的實(shí)驗(yàn)中，PP2A強(qiáng)有力的抑制劑岡田酸（Okadaic acid，OA）可激活PP2A下游的MAPK通路和ERK通路而有效地促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[7]。另外，在胃腸道間質(zhì)瘤中，PP2A的突變，可以促進(jìn)Akt1/2，ERK1/2，and WNK1等血管生成相關(guān)通路的磷酸化，導(dǎo)致腫瘤加速生。而我們的實(shí)驗(yàn)表明，乳腺癌患者中癌組織的PP2A表達(dá)量要低于癌旁組織。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)表明PP2A的功能缺失增強(qiáng)了乳腺癌干細(xì)胞的增殖和自我更新能力。上述研究結(jié)果提示，PP2A可能是抑制乳腺癌干細(xì)胞“干性”的重要分子，這種作用可能通過(guò)介導(dǎo)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的去磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)。

本研究初步證明了PP2A在乳腺癌組織中低表達(dá),有類(lèi)似抑癌基因的作用, 降低乳腺癌細(xì)胞系干細(xì)胞PP2A的表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的增殖，抑制其分化。但PP2A通過(guò)哪些信號(hào)通路影響腫瘤干細(xì)胞的“干性”仍需要進(jìn)一步的研究。本研究為PP2A作為靶向腫瘤的分子治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，說(shuō)明PP2A具有成為乳腺癌基因治療新靶點(diǎn)的潛力。