分子生物學(xué)方法在毒萵苣及其近似種上的應(yīng)用

鄭煒，趙雷，劉斌

(寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 寧波 315000)

毒萵苣是一種危險性較大的有毒雜草，不僅嚴(yán)重危害糧食作物的生產(chǎn)安全，而且易引起人畜中毒，近年來國內(nèi)外學(xué)者對其形態(tài)特征、危害性、生態(tài)、生物學(xué)特性等進(jìn)行了系列研究。郭水良等[1]對檢疫性雜草毒萵苣的光合特征及其入侵地群落學(xué)進(jìn)行了生態(tài)調(diào)查；孫立彥等[2]對山萵苣進(jìn)行了核型分析研究；范明松等[3]從山萵苣植株中分離并鑒定出13個化合物，為醫(yī)藥化合物的開發(fā)提供了條件；王棟等[4]測定了蒙山萵苣根、葉、莖的浸提液對4種草坪雜草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響；畢志明等[5]從多裂山萵苣的根中分離鑒定出7種化合物；梁照文等[6]對毒萵苣及其近似種進(jìn)行了EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)，構(gòu)建了11個毒萵苣及其近似種的系統(tǒng)發(fā)育樹。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)為近年來進(jìn)展最迅速的學(xué)科前沿之一，已被廣泛應(yīng)用于多個物種的種類鑒定。而毒萵苣及其近似種在這方面的研究基本還處于空白。為此，本研究選取了ITS區(qū)作為研究對象，收集了以毒萵苣為主的幾種萵苣屬植物，設(shè)計(jì)了一對特異性引物，對其rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行了測序驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料1號山萵苣、2號毒萵苣、3號萵苣均采自寧波北侖，4號毒萵苣采自河南新縣。

1.2 DNA提取

采用高效植物基因組DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit提取DNA，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中毒萵苣的現(xiàn)有序列，設(shè)計(jì)1對引物，上游引物為ATGCGATACTTGGTGTGAAT，下游引物為AGTTTCTTTTCCTCCGCTT，退火溫度為53 ℃。

1.4 rDNA-ITS區(qū)片段PCR擴(kuò)增

PCR采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase 20 μL反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，Template DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR儀為ABI GeneAmp? 9700型。

PCR反應(yīng)參數(shù)為95 ℃、5 min為1個循環(huán)；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s共27個循環(huán)；72 ℃ 10 min；10 ℃保溫。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.5 純化和測序

采用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收，測序工作在上海凌恩生物科技有限公司的ABI Prism 3730 DNA自動測序儀上完成，測序引物為CAGAATCCCGTGAACCATCG。

2 結(jié)果與分析

由圖1～2可知，4種萵苣屬植物均擴(kuò)增出有效的目的片段，ITS區(qū)序列長度都在300～400 bp，設(shè)計(jì)的引物通用性適用，擴(kuò)增和測序成功率在100%。

圖1 Maker標(biāo)記

圖2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行序列比對(圖3)可知，山萵苣序列相似度在98%，萵苣和毒萵苣相似度在99%。根據(jù)genedoc軟件比對序列，并mega做進(jìn)化樹(圖4)可以看出，萵苣屬內(nèi)ITS去序列種間的差異較小，大概在25個堿基左右。從進(jìn)化樹看，不同采集地的毒萵苣并列成1支，山萵苣和萵苣自成1支，種間遺傳距離差異較小。

圖3 毒萵苣及其近似種序列差異

圖4 毒萵苣及其近似種遺傳進(jìn)化樹

3 討論

植物DNA序列由于在不同物種、不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育研究中存在保守性差異，因此針對某一特定的系統(tǒng)學(xué)問題選擇相適應(yīng)的分子片段是序列分析中最為關(guān)鍵的一步[7]。rDNA-ITS區(qū)序列作為一種基于測序的標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用于觀賞植物和藥用植物中。吳玲等[8]對藥用植物石蒜屬13個種(含變種)的親緣關(guān)系進(jìn)行了ITS序列分析，并將其分為三大類；王東等[9]采用PCR直接測序技術(shù)進(jìn)行山藥rDNA ITS區(qū)序列的測定，從分子水平上鑒定和評價道地藥材品質(zhì)性狀的變異和品質(zhì)差異，以及不同品種之間的親緣關(guān)系等。

本研究通過設(shè)計(jì)的引物，比較了4種萵苣屬植物的ITS區(qū)序列的差異，由于該區(qū)域?qū)賰?nèi)種間差異較小，種間的差異不很顯著，但試驗(yàn)得到的該屬的ITS區(qū)序列資料在探討屬內(nèi)分組、種間關(guān)系等分類價值方面具有一定的參考價值，為萵苣屬的種類鑒定和種間親緣關(guān)系提供分子生物學(xué)的理論依據(jù)。由于本研究得到的樣本數(shù)量較少，毒萵苣及其同屬內(nèi)近似種的特異性差異未做鑒定，有待進(jìn)一步的研究。