利用SSR標(biāo)記分析26份南瓜種質(zhì)的遺傳多樣性

周秦，郭子卿，朱璞，徐誠(chéng)，徐恒輝

(1.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321000； 2.金華雙依種子有限公司，浙江 金華 321000)

南瓜屬(Cucurbita)是一個(gè)大族群，種質(zhì)資源十分豐富，因其抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)性好，地域分布廣，高產(chǎn)耐貯，果實(shí)形狀、大小、品質(zhì)各異，果色繽紛多彩，現(xiàn)已在世界各地廣泛栽培[1]。隨著人們對(duì)南瓜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值認(rèn)識(shí)的增加，對(duì)南瓜屬資源利用的深入，以及在南瓜進(jìn)行不同品種間雜交試驗(yàn)過程中，研究者們逐漸意識(shí)到南瓜種質(zhì)資源研究的重要性，狹窄的遺傳基礎(chǔ)難以培育出突破性品種[2]。

SSR(simple sequence repeats，微衛(wèi)星序列即簡(jiǎn)單重復(fù)序列)分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、成本低廉、呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系分析，指紋圖譜構(gòu)建等[3]。盧亞楠等[4]利用RAPD、ISSR和SSR三種標(biāo)記方法對(duì)36份西葫蘆(美洲南瓜)的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析鑒定，三種標(biāo)記中SSR標(biāo)記的多態(tài)性最高。Gong等[5]采用SSR標(biāo)記和SCAR標(biāo)記對(duì)104份美洲南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系的鑒定，134對(duì)SSR引物和4個(gè)SCAR標(biāo)記共擴(kuò)增出418個(gè)位點(diǎn)，分布于20個(gè)連鎖群。劉超[6]采用35對(duì)SSR引物對(duì)76份不同來(lái)源的籽用南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行SSR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記能夠準(zhǔn)確地將種質(zhì)依據(jù)來(lái)源進(jìn)行分類。

本研究利用SSR標(biāo)記技術(shù)分析26份南瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性并進(jìn)行類群劃分，估計(jì)其遺傳距離和性狀分類距離的相關(guān)性，以期為育種者開展種質(zhì)鑒定與創(chuàng)新、優(yōu)良品種選育和親本組配等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共26份(表1)，均為金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所南瓜育種課題組經(jīng)過收集、試種篩選獲得，分別為筍瓜、中國(guó)南瓜、中國(guó)南瓜與筍瓜雜交材料，主要來(lái)源于日本和國(guó)內(nèi)其他地區(qū)引進(jìn)的材料，少量為浙江省內(nèi)的農(nóng)家留種。

表1 參試南瓜的品系及來(lái)源

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

26份供試材料于3月5日播種于育苗聯(lián)棟大棚，3月31日取其第二片真葉約0.5 g，采用改良CTAB法進(jìn)行DNA提取，利用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖檢測(cè)DNA質(zhì)量、濃度。將基因組DNA原液于-20 ℃保存，PCR擴(kuò)增時(shí)取適量稀釋為25 ng·μL-1備用。

1.2.2 SSR引物合成與PCR擴(kuò)增

選擇26對(duì)SSR引物[7](表2)，由金斯瑞生物科技有限公司合成，Taq酶購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司。PCR實(shí)驗(yàn)體系15 μL，其中dNTPs 2.4 μL(1.25 mol·L-1)，引物各0.2 μL(10 μmol·L-1)，酶0.2 μL(5 U·μL-1)，10×緩沖液1.4 μL(含Mg2+)，DNA約40 ng。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃退火5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃(不同引物復(fù)性溫度不同)復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存10 min。

表2 SSR引物序列與名稱

PCR產(chǎn)物采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測(cè)。方法：取下膠板，純凈水沖洗2次；放入0.2% AgNO3中染色15 min；取出純凈水沖洗2遍；放入顯影液中：15 g NaOH+7 mL甲醛+2 L水；取出水洗，照相。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)SSR標(biāo)記顯示的帶型，記錄易于辨認(rèn)且擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的多態(tài)性位點(diǎn)，根據(jù)各條帶的遷移率及其有無(wú)統(tǒng)計(jì)得到所有位點(diǎn)的二元數(shù)據(jù)，有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”。應(yīng)用非加權(quán)平均數(shù)法UPGMA進(jìn)行聚類分析，通過NTSYS[8]遺傳分析軟件程序運(yùn)算，利用Tree-Plot模型繪制生成樹狀圖。根據(jù)Smith等[9]的方法計(jì)算標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)信息量PIC(polymorph ism index content)值，PIC值反映某一群體中遺傳多樣性豐富程度，PIC值與等位基因的數(shù)目有關(guān)，并與等位基因的頻率有關(guān)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性

從26對(duì)SSR引物中共篩選出22對(duì)擴(kuò)增結(jié)果較好的引物，能明顯擴(kuò)增出穩(wěn)定多態(tài)性條帶(圖1)。在26份南瓜材料中共檢測(cè)出98個(gè)等位基因變異，每對(duì)引物的等位基因變異數(shù)為1～12個(gè)，平均為4.5個(gè)；其中引物CMTp260擴(kuò)增的等位變異最多達(dá)12個(gè)，引物CMTp145擴(kuò)增的等位變異最少為1個(gè)。SSR標(biāo)記的多態(tài)信息量PIC為0.148(CMTp145)～0.840(CMTp260)，平均為0.460(表3)。

圖1 引物CMTp256對(duì)26份南瓜材料DNA的擴(kuò)增結(jié)果

編號(hào)引物名稱等位變異數(shù)多態(tài)性信息含量編號(hào)引物名稱等位變異數(shù)多態(tài)性信息含量1CMTp19380.71312CMTp14240.4462CMTp9860.62813CMTp5830.4493CMTp13120.39714CMTp14510.1484Cmtp18760.66815CMTp6640.3965CMTp6340.30216CMTp260120.8406CMTp8890.78417CMTp6930.5017CMTp23540.26618CMTp17640.2588CMTp25640.45719CMTp8630.2039CMTp22470.75220CMTp16930.27810CMTp24830.35021CMTp23130.15611CMTp25730.55422CMTp20920.500

2.2 聚類

根據(jù)遺傳相似性系數(shù)矩陣，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，得到26份供試材料的遺傳關(guān)系樹狀圖(圖2)，可分成2個(gè)類群。第Ⅰ類群較大，共有23份材料，均為筍瓜類型，分成6個(gè)亞群：第1個(gè)亞群僅1份材料(1號(hào))；第2個(gè)亞群包括11份材料(3號(hào)、18號(hào)、14號(hào)、22號(hào)、9號(hào)、21號(hào)、7號(hào)、17號(hào)、11號(hào)、8號(hào)、10號(hào))，其中3號(hào)和18號(hào)親緣關(guān)系很近，本試驗(yàn)所用的22對(duì)引物無(wú)法將其區(qū)分開來(lái)，可能是姊妹系，8號(hào)和10號(hào)較好地聚在一起，且10號(hào)的系譜信息顯示其含有25%的8號(hào)的血緣；第3個(gè)亞群包括7份材料(4號(hào)、5號(hào)、16號(hào)、15號(hào)、20號(hào)、24號(hào)、25號(hào))，其中4號(hào)、5號(hào)、16號(hào)較好地聚在一起，根據(jù)系譜信息顯示三者為同質(zhì)遺傳型組成品種的再組合；第4個(gè)亞群僅1份材料(12號(hào))；第5個(gè)亞群包括2份材料(2號(hào)、19號(hào))；第6個(gè)亞群僅1份材料(23號(hào))。

第Ⅱ類群共有3份材料，與第Ⅰ類群的遺傳距離較遠(yuǎn)，達(dá)0.4。分成2個(gè)亞群：第1個(gè)亞群包括2份材料(6號(hào)、26號(hào))，均為中國(guó)南瓜類型；第2個(gè)亞群僅1份材料(13號(hào))，為中國(guó)南瓜與筍瓜雜交所得，與其余品系的遺傳距離最遠(yuǎn)，相比于筍瓜類型與中國(guó)南瓜類型更靠近。利用SSR分子標(biāo)記做出的聚類結(jié)果基本可以將供試材料按照不同品種群分開，這與前人按照植物化學(xué)分類法(主要是同工酶及等位酶)進(jìn)行種內(nèi)分類的結(jié)果是相符的[11]。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，筍瓜與中國(guó)南瓜間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，這與其他采用不同標(biāo)記手段得出的分類結(jié)論一致[12-13]。在南瓜育種中，選擇遺傳差異豐富的親本進(jìn)行雜交可以擴(kuò)大遺傳基礎(chǔ)。利用SSR分子標(biāo)記可以從分子水平上區(qū)分不同品種間的遺傳距離，不受環(huán)境條件對(duì)植物形態(tài)的影響，十分穩(wěn)定可靠，是一種理想的遺傳多樣性分析技術(shù)。本研究利用26對(duì)南瓜SSR引物，對(duì)26份南瓜種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，其中22對(duì)引物能明顯擴(kuò)增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶，共檢測(cè)出98個(gè)等位基因變異，平均每對(duì)引物的等位基因變異數(shù)為4.5個(gè)，平均多態(tài)信息量為0.46。26份材料可以分為2個(gè)類群，與可追溯的系譜信息基本一致。

1～26為品種編號(hào)見表1圖2 26份南瓜種質(zhì)聚類結(jié)果

研究結(jié)果表明，收集到的南瓜種質(zhì)資源中，2份中國(guó)南瓜材料之間差異較大，23份筍瓜材料的種間遺傳組成上差異較小，遺傳基礎(chǔ)狹窄，品種(系)間的遺傳多態(tài)性不豐富，推測(cè)可能多為同質(zhì)遺傳型組成品種的再組合。因此，還需要繼續(xù)收集更多的國(guó)內(nèi)外種質(zhì)材料，加大新材料的引進(jìn)力度，加強(qiáng)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)地區(qū)間的基因交流及關(guān)鍵基因挖掘；在傳統(tǒng)育種的基礎(chǔ)上結(jié)合遠(yuǎn)緣雜交、胚挽救、輻射誘變等生物技術(shù)手段的應(yīng)用，積極開展種間雜交試驗(yàn)，進(jìn)而建立雜種優(yōu)勢(shì)利用模式，為南瓜種質(zhì)資源保存和新品種選育提供理論依據(jù)。