不同清香型大曲理化生化指標和揮發(fā)性成分分析

馬茹菲，馬玉帛，佟世生，劉 萍

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083；2.東北師范大學附屬中學國際部，吉林長春130377；3.北京城市學院生物醫(yī)藥學部，北京100094）

白酒是我國傳統(tǒng)的蒸餾酒，在中國文化和人們的日常生活中都扮演著重要的角色。白酒的流行一部分因素是由于其口味的多樣性，根據(jù)香型可以將其分為濃香型、清香型和醬香型等[1]。白酒是以谷物（主要是高粱）為原料，通過發(fā)酵、蒸餾和貯存（陳釀）而制成。大曲是一種重要的糖化發(fā)酵劑，用于生產(chǎn)白酒和醋，對于產(chǎn)品風味的形成具有重要的影響[2-3]。大曲本身也是通過發(fā)酵而制成，大約需要1個月的時間，并進行6個月的成熟儲存期[4]。

清香型白酒是我國最古老的酒種之一，具有清香純正、醇甜柔和、自然協(xié)調(diào)、余味爽凈的特點[5]。清香純正即主體香乙酸乙酯與乳酸乙酯搭配協(xié)調(diào)，琥珀酸的含量也很高，無雜味，也可稱酯香勻稱，干凈利落[6]。清香型大曲系用大麥、豌豆為原料制成，為我國古老曲種之一。制曲的目的主要是利用多種酶類的生化性能，使它變成我國獨特形式的糖化劑和發(fā)酵劑。質量上乘的大曲是生產(chǎn)優(yōu)質清香型白酒的關鍵所在，是最終形成白酒獨特風格的決定因素。

“曲是酒之骨，好曲出好酒”，因此大曲在白酒釀造過程中起著非常重要的作用[7-8]。但是由于制曲過程中環(huán)境的高度開放性和不確定性等諸多不可控因素，使得酒曲品質缺乏統(tǒng)一性和穩(wěn)定性。傳統(tǒng)大曲的品質評定只局限于感官層面，但隨著監(jiān)測手段的發(fā)展和科學技術的進步，更多的理化指標和生化參數(shù)參與到了大曲質量的評定之中?；诖朔N情況，本研究以不同來源的清香型白酒大曲作為研究對象，分別從感官評價、理化參數(shù)、生化指標和揮發(fā)性成分等角度分別對幾種樣品大曲進行品質分析，為大曲評定標準的統(tǒng)一化和清香型白酒生產(chǎn)發(fā)酵劑的優(yōu)化提供一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

6種不同來源的清香型大曲樣品分別取自山西、江蘇、四川和山東的當?shù)鼐茝S，大曲均為紅心、清茬、后火3種大曲混合而成。將采集得到的大曲粉碎后過40目篩，采用四分法混合均勻后于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩悠沸畔⒁姳?。

表1 各樣品名稱及簡稱

1.2 實驗方法

1.2.1 大曲的感官評定

大曲的感官品質可以依據(jù)外觀、斷面和香味等感官指標來初步描述。香味：將曲塊折斷后用鼻子嗅，是否香味撲鼻，無酸臭等其他異味。外觀：是否灰白一片，無異色，穿衣均勻，無裂口，光滑。斷面：是否灰白色一片，有較密集的菌絲生長，斷面層次是否均勻等。

1.2.2 大曲中微生物分析

準確稱取10 g大曲粉加入裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，搖床充分振蕩30 min，取1 mL加入到裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，得到10-2稀釋液，依次操作得到10-3、10-4和10-5稀釋液。吸取0.1 mL稀釋液加入培養(yǎng)皿中，倒入溫度適中的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基和馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，搖晃混勻，待凝固后倒置，前兩個放入35℃培養(yǎng)箱中，后兩個放入30℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1～2 d后，分別對細菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌進行計數(shù)[9]。

1.2.3 大曲中理化和生化指標分析

大曲中的水分、淀粉、酸度、發(fā)酵力、液化力、糖化力和酯化力的測定參照行業(yè)標準《釀酒大曲通用分析方法》[10]。標準規(guī)定，水分含量以百分比表示；淀粉含量為每100 g大曲中含有淀粉的質量，單位為g/100 g；酸度為10 g絕干大曲消耗0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液的毫摩爾數(shù)，單位為mmol/10 g。發(fā)酵力表示為在30℃下，72 h內(nèi)0.5 g大曲利用可發(fā)酵糖類所產(chǎn)生的二氧化碳克數(shù)為一個發(fā)酵力單位，以（g/0.5 g·72 h）表示；液化酶活力表示為在35℃、pH4.6條件下，1 g絕干曲1 h能液化淀粉的克數(shù)為一個液化力單位，符號為U，以U/g表示；糖化力表示在35℃、pH4.6條件下，1 g絕干曲1 h轉化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數(shù)為一個糖化力單位，符號為U，以U/g表示；酯化酶活力為每50 g大曲在35℃下，經(jīng)過7 d催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數(shù)為一個酯化力單位，符號為U，以U/50 g表示。

蛋白酶活力測定方法參照國家標準SB/T 10317—1999。酶活定義：在40℃條件下，1 g大曲每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個蛋白酶活力單位，以U/g表示。

纖維素酶測定方法采用DNS法[11]，酶活定義：在50℃，自然pH值條件下，1 g大曲每分鐘催化纖維素水解生成1 μg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位，以U/g表示。

1.2.4 大曲的揮發(fā)性成分分析

參考Ding等[12]使用的方法：準確稱取1.00 g大曲樣品放入頂空瓶中，再加入20 μL 2-辛醇甲醇溶液 (0.82 g/L)，蓋上瓶蓋。取 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在磁力攪拌器上插入加有20 μL 2-辛醇甲醇溶液和1.00 g大曲的頂空瓶，萃取溫度60℃，頂空吸附45 min，再插入溫度為250℃的氣質聯(lián)用儀上解吸5 min后進行檢測。

氣相色譜條件：氦氣作為載氣，流速控制為1 mL/min；升溫程序：起始溫度40℃，維持5 min，以5℃/min升至220℃，維持5 min；氣化室溫度為250 ℃；分流比為10∶1。

質譜條件：選擇電子轟擊電離離子源（EI），電子能為70 eV，離子源溫度為230℃，質量范圍控制在40～400 u。

利用保留系數(shù)對揮發(fā)性組分進行定性分析，并計算各樣品中各類揮發(fā)性組分的相對豐度。

1.2.5 統(tǒng)計分析

所有樣品重復做3次平行，結果表示為平均值±標準偏差。使用方差分析(ANOVA)對不同樣品中微生物數(shù)量和理化生化指標等進行顯著性分析（P＜0.05）。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 20.0和Excel 2013。

2 結果與討論

2.1 不同大曲感官特征的評定

對于大曲的判定標準，在外觀方面主要表現(xiàn)為外觀、斷面和香味等指標，本實驗選擇了6種不同來源的清香型大曲樣品，對其感官特征進行分析比較，結果見表2。

從外觀角度比較，F(xiàn)J、TY大曲樣品色澤單一無雜色，菌絲均勻整齊，無裂口；從斷面角度比較，F(xiàn)J、TY和XY大曲樣品無論是色澤還是泡氣程度等性狀都比其他樣品好；FJ、TY、XY大曲樣品在香氣上也表現(xiàn)出濃郁且無雜味的良好特征，而JS、SC、SD這3種大曲的曲香表現(xiàn)為淡薄且夾雜輕微異味。

2.2 不同大曲主要微生物的種類和數(shù)量分析

不同清香型大曲樣品的細菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌數(shù)量見表3。

表3反映了大曲中細菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌的數(shù)量與感官評定之間的關系。TY大曲樣品中細菌和芽孢桿菌的數(shù)量相比于其他樣品均較高，其中芽孢桿菌的數(shù)量分別是來自相同區(qū)域的FJ和XY數(shù)量的3倍左右，而芽孢桿菌與大曲的曲香有一定的相關性。表中FJ、TY、XY 3種樣品相比于其他樣品在霉菌數(shù)量方面差異顯著，高出近一個數(shù)量級。感官評價的結果顯示，F(xiàn)J、TY、XY 3種大曲的“穿衣”均優(yōu)于其他大曲，大曲的“穿衣”一般是微生物尤其是霉菌生長好壞的外在表現(xiàn)特征，由于霉菌在生長繁殖過程中可產(chǎn)生糖化酶、液化酶、蛋白酶、纖維素酶等多種酶類，所以霉菌的生長繁殖狀況對各種酶活力有很大的影響，即大曲穿衣是評定大曲質量的一個重要標準[13]。

2.3 不同大曲理化成分分析

衡量大曲的理化性質，可以用水分、淀粉含量、酸度以及蛋白質含量等理化成分指標進行比較，分別測定6種清香型大曲的相關指標，結果見表4。

表2 對不同清香型大曲的外觀、斷面和香味等感官特征的比較

表3 6種清香型白酒大曲中微生物數(shù)量比較(log cfu/g)(n=3)

成品大曲的水分表征了大曲所含水分的多少，隨貯藏時間的延長，大曲的水分含量逐漸減少，表明發(fā)酵產(chǎn)生的游離水越多，揮發(fā)能力強，大曲的成熟度更佳。根據(jù)制曲車間成品大曲出廠檢驗標準的相關規(guī)定，大曲中的水分含量不能超過總質量的13%，根據(jù)表4結果顯示，幾種樣品大曲水分含量均合格。

在制曲過程中，曲塊發(fā)生了復雜的發(fā)酵過程，而大曲的酸度正是由曲塊中的蛋白質、脂肪等產(chǎn)酸微生物進行有機代謝產(chǎn)生，大曲酸度是反映大曲微生物的新陳代謝和評定大曲質量的重要指標。表3反映出TY大曲樣品酸度明顯高于其他樣品，其余大曲酸度含量也有所差異，但與白鋼等[14]的研究結果基本相同，其揭示出不同大曲樣品中產(chǎn)酸微生物的數(shù)量有較大差異[15]。分析表4可知，SD、JS大曲樣品淀粉含量相對較高，大曲中淀粉含量與其糖化酶和液化酶活性關系密切，在制曲過程中，制曲微生物產(chǎn)生的糖化酶和液化酶活性越高，顯著地表現(xiàn)出對淀粉原料的降解和消耗。在蛋白含量方面幾種大曲樣品同樣表現(xiàn)出明顯的差異，其中SD樣品中蛋白質含量高達24.26 mg/g，而SC樣品中蛋白質含量只有8.76 mg/g。

2.4 不同大曲發(fā)酵力和酶活力比較

大曲的發(fā)酵力和酶活力是反映大曲品質的重要生化指標，比較不同大曲樣品的發(fā)酵力以及液化酶、糖化酶、蛋白酶、纖維素酶和酯化酶等5種酶活力的情況，結果見表5。

二氧化碳的失重表征了大曲的發(fā)酵力，6種大曲的發(fā)酵力情況見表5。由表5可看出，不同清香型大曲樣品的發(fā)酵能力不同。其中XY、TY、JS和FJ樣品發(fā)酵力均較強，表明其中微生物的生長代謝和繁殖的速度較快。

大曲中的酶系是分解大曲中淀粉和蛋白質等原料的動力，分解產(chǎn)物為微生物的新陳代謝提供物質基礎。表5顯示，幾種大曲中液化酶活力較小，均保持在0.5～1.1 U/g的范圍內(nèi)。大曲中微生物尤其是霉菌的生長繁殖狀況與液化酶活力有緊密的聯(lián)系，從實驗結果可以看出，F(xiàn)J、TY大曲樣品液化酶活力相對較高。糖化酶活力差異較為顯著，高低差異可達4倍，最高者為XY大曲樣品，為502.1 U/g，最低者SC大曲樣品同時也是液化酶活力最低。6種大曲的蛋白酶活力也有明顯差異，其中XY、FJ大曲樣品中蛋白酶活力大于100 U/g。曲霉、毛霉、根霉和芽孢桿菌廣泛存在于大曲中，這些產(chǎn)蛋白酶微生物的生長繁殖狀況是大曲中蛋白酶活力高低的關鍵因素[16]。蛋白酶可分解蛋白質生成氨基酸，氨基酸能夠參與美拉德反應生成風味物質，有利于促進大曲風味前體物質的形成；蛋白酶活力越高，曲香表現(xiàn)越濃郁，這與大曲感官評定中的香味判定標準相一致。FJ、TY大曲樣品的纖維素酶活力高于其他樣品，纖維素酶在白酒釀造中起著重要的作用，它能夠將纖維素類原料降解為微生物可利用的糖類，提高對原料的利用率。TY大曲樣品中酯化酶活力明顯較高，大曲中的酯類化合物與大曲風味的形成密切相關，大曲的酯化酶活力是催化產(chǎn)生這些酯類化合物的動力，酯化酶活力越高則大曲在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酯類化合物越多，這有利于促進白酒風味的形成[17]。

表4 幾種清香型白酒大曲理化成分

表5 不同清香型大曲發(fā)酵力和酶活力比較

2.5 不同大曲揮發(fā)性成分分析

6種不同的大曲樣品共檢出了78種揮發(fā)性組分，根據(jù)其化學結構特點，分為醇類（9）、酸類（3）、酯類（17種）、醛類（4）、酮類（8）、烷類（19）、其他類（18）組分。各樣品中揮發(fā)性組分種類及所占比例分別見圖1和圖2。

圖1 各樣品中揮發(fā)性物質的種類

圖2 各類揮發(fā)性組分在各樣品中所占的比例

從圖1和圖2可以看出，不同清香型大曲樣品中揮發(fā)性成分的種類和相對豐度有所差異，其中醇類、酯類、酮類、醛類和烷類為含量相對較高的化合物?；衔锓N類的數(shù)量一定程度上體現(xiàn)了大曲樣品中微生物的代謝情況。在FJ、TY、XY、JS、SC、SD大曲樣品中分別檢測到31種、34種、41種、20種、25種、24種物質，說明FJ、TY、XY大曲樣品中揮發(fā)性成分更復雜。其中FJ樣品中檢測到最多種類的醇類和酮類，XY樣品中檢測到最多種類的酯類和烷類。綜合檢測結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)J、TY、XY樣品揮發(fā)性成分豐富，這與感官評價中曲香較濃郁的結論相一致。

從化合物種類角度分析，較高含量的醇類是大曲微生物代謝的前體物質，醇類是形成酯類的重要物質基礎，而酯類和芳香族化合物又構成了大曲的獨特曲香。醇類主要由酵母在有氧條件下利用糖發(fā)酵生成，而在厭氧條件下通過氨基酸生成，或者由酵母利用相應的醛通過化學還原反應形成[18]。高級醇含量可以在一定程度上反映大曲中酵母菌的代謝情況。

酯類是揮發(fā)性成分中較為重要的呈香物質，其中大曲中的部分酯類物質也會進入到大曲酒中形成酒中獨特的風格。其中白酒中的酯類物質主要包括兩大類，分別是乙酸酯和乙醇酯。乙醇酯是由乙醇和其他有機酸在相應酶的催化下脫水縮合而成；而乙酸酯則是由除乙醇外的醇類物質在催化條件下合成。在樣品大曲中檢測到多種酯類，酯類化合物一般具有水果等令人愉悅的芬芳香氣，對白酒獨特風味和品格的形成具有重要作用。

脂肪酸類物質的來源既包括產(chǎn)酸細菌的代謝也包括真菌的代謝，脂肪酸類物質同樣是形成酯類的前體物質，同時在白酒中產(chǎn)生特定的香味或酸腐味，很大程度上影響著白酒的口感。大曲中醛酮類物質可由微生物降解大曲原料中的淀粉類物質，在糖酵解過程中尤其是在酵母的作用下產(chǎn)生。它們與大曲中的酯類物質共同構成了大曲的獨特曲香，并且酮類和醛類也會通過發(fā)酵進入大曲酒中，作為微生物代謝的前體物質參與酒香的形成。

3 結論

本研究從感官特征、微生物指標、理化生化指標和揮發(fā)性成分等方面出發(fā)，選取不同地區(qū)的6種清香型大曲進行了品質分析。結果表明，在感官特征（外觀、斷面、香味）方面，F(xiàn)J、TY、XY這3種清香型大曲樣品菌絲均勻，色澤灰白良好，泡氣整齊，曲香濃郁，其他3種樣品感官評價較差。在微生物方面，不同樣品中細菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌的數(shù)量差異明顯，其中FJ、TY、XY樣品大曲中微生物數(shù)量較多，微生物尤其是霉菌數(shù)量的不同與大曲的感官特征關系密切，同時也是其代謝產(chǎn)生酶系活力差異的重要原因；在理化指標方面，大曲樣品水分含量適宜，F(xiàn)J、TY、SC大曲樣品自身淀粉的消耗較多，同時TY大曲酸度顯著高于其他樣品；對生化酶活性分析結果表明，F(xiàn)J、TY、XY大曲有較好的發(fā)酵能力，液化力、糖化力、酯化能力都較強；在揮發(fā)性成分方面，醇類、酯類、酮類、醛類和烷類為大曲樣品中含量相對較高的化合物，其中在FJ、TY、XY樣品中檢測到較多的揮發(fā)性成分，這與感官評價中曲香較濃郁的結論相一致。要建立較準確的大曲質量標準，需綜合感官指標、微生物指標以及理化生化指標等多個參數(shù)共同進行評定，還需要進一步研究各個指標對釀酒品質的影響程度，重新對其進行權衡，制定出行業(yè)統(tǒng)一標準，從而幫助推動制曲專業(yè)化的進一步發(fā)展。