筋膜源性干細(xì)胞的分離和鑒定研究

史簡銘 田進翔 辛超飛 龔漢普 常英健 李廣恒 許建中

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，鄭州 450052）

骨關(guān)節(jié)炎在60歲以上的老年人群中的發(fā)病率達10%，而軟骨自我修復(fù)的能力非常有限，加之老齡化的加劇，骨關(guān)節(jié)炎在各國的發(fā)病率逐年上升[1]。目前骨關(guān)節(jié)炎早期的治療措施主要包括抗炎藥物的使用、關(guān)節(jié)腔使用潤滑劑；骨關(guān)節(jié)炎后期的治療主要為外科手術(shù)治療。近年來動物實驗和臨床研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞在骨關(guān)節(jié)炎治療上具有良好的應(yīng)用前景[2-4]，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠進行自我更新和具有多向分化的能力，而當(dāng)前的研究中間充質(zhì)干細(xì)胞的來源主要有骨髓源性干細(xì)胞、脂肪源性干細(xì)胞、滑膜源性干細(xì)胞等[5,6]。而骨髓源性干細(xì)胞的來源比較局限，取材時給患者造成一定創(chuàng)傷，且有感染的風(fēng)險；脂肪源性干細(xì)胞雖來源豐富但其成軟骨分化能力較弱，而近來研究雖然表明關(guān)節(jié)腔周圍存在固有間充質(zhì)干細(xì)胞，但是骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜存在嚴(yán)重炎性改變，使其難以成為理想的來源[7]。本實驗旨在探究鼠筋膜源性干細(xì)胞的分離，體外培養(yǎng)和鑒定，并在多向分化的潛能上進行研究，以明確筋膜源性干細(xì)胞是否具有誘導(dǎo)成軟骨分化能力。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠來源

本實驗所用大鼠軟骨細(xì)胞和筋膜源性干細(xì)胞均由SD 大鼠體內(nèi)分離所得，大鼠來源于北京維通利華有限公司【SCXK（京）2016-0011】。實驗大鼠均為SPF級，8周齡，體重約240 g，實驗過程中對動物的處置符合赫爾辛基宣言動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco，11330-032），胎牛血清（Thermo Fisher，10099141），Ⅱ型膠原酶（索萊寶，C8150），胰酶（Thermo Fisher，25200056）PE標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD29 單克隆抗體（Thermo Fisher，25029180）、小鼠抗大鼠CD90 單克隆抗體（Thermo Fisher，12090081），F(xiàn)ITI標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD45單克隆抗體（Thermo Fisher，11046180），APC 標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD71 單克隆抗體（Thermo Fisher，17071082），BMP4（Peprotech，12005）、TGF-β3（Peprotech，10036E），成脂誘導(dǎo)分化試劑盒（Cyagen，RASMD-90031），成軟骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)液（CCM005，R&D systems），成軟骨誘導(dǎo)分化添加劑（CCM020，R&D systems），流式細(xì)胞儀（BD FASCAria III），細(xì)胞計數(shù)儀（IC1000，上海睿鈺公司），培養(yǎng)用顯微鏡（CKX53，OLYMPUS），離心機（湘儀L500，離心腔直徑Ф320 mm，離心直徑Ф300 mm）。

1.3 筋膜細(xì)胞的分離

將大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉過量處死，用電動剃須刀給予大鼠后肢備皮處理，將大鼠浸泡于75%乙醇溶液10 min，用吸水紙擦干大鼠表面的乙醇，轉(zhuǎn)移至無菌操作臺中，用無菌齒鑷提起大鼠臀大肌表面的皮膚，用組織剪橫行剪開，用組織剪鈍性分離至臀大肌表面筋膜，用剪刀小心分離筋膜組織[8]，取出后的筋膜組織用組織洗液（含有10%青鏈霉素）清洗數(shù)遍至筋膜組織呈現(xiàn)近似透明的絮狀，把組織轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中，并置于冰上，盡可能剔除血管、脂肪等組織，用眼科剪剪碎筋膜組織至糊狀，用移液管轉(zhuǎn)移剪碎的筋膜組織至15 ml離心管中，加入等體積的0.25%的Ⅱ型膠原酶，振蕩混勻后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化1 h，每間隔30 min混勻振蕩1次，后再加入0.2%的胰酶消化30 min，消化完成后轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，用10倍體積的完全培養(yǎng)基（含10%的FBS）中止消化，中止消化后，1000 r/min離心5 min，離心機半徑為15 cm，離心后去除上層懸液，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用100目的尼龍濾網(wǎng)過濾，濾過的細(xì)胞懸液接種在25 cm培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，72 h后首次換液，以后每48 h換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合至70%的時候用0.25%胰酶消化后傳至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)擴增培養(yǎng)。

1.4 軟骨細(xì)胞的分離

取4只SD大鼠，過量麻醉處死后，浸泡于75%的酒精中30 min，在股骨近端處切下大鼠的雙側(cè)后肢，剪去皮層，置于50 ml 離心管中，用組織洗液反復(fù)洗滌數(shù)遍，在培養(yǎng)皿中打開大鼠的膝關(guān)節(jié)，用眼科剪，沿著軟骨下分別減去股骨髁和脛骨平臺，剪下的組織置于50 ml離心管中用組織洗液反復(fù)洗滌10遍，在無菌的培養(yǎng)皿中仔細(xì)分離剪下的軟骨組織，把軟骨周圍的滑膜組織，軟骨下骨徹底分離，收集取得的軟骨，用手術(shù)刀片反復(fù)切取組織，直至組織變的粘稠狀，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，加入0.15%Ⅱ型膠原酶3 ml，置入恒溫培養(yǎng)箱中消化1 h，期間每隔20 min 振蕩混勻一次，1 h 后加入0.25%胰酶2 ml 消化30 min，把消化后的組織倒入50 ml離心管中，加入帶有血清的培養(yǎng)基20 ml中止消化，并用100目的濾網(wǎng)進行過濾，收集過濾后的液體，1000 r/min 離心5 min，離心機半徑為15 cm，棄上清，用含有10%FBS 的DMEM/F-12 重懸細(xì)胞，重懸后接種至25 cm的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞融合至80%的時候常規(guī)消化后傳至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)擴增培養(yǎng)。

1.5 筋膜源性干細(xì)胞生長曲線繪制

取第3、5、7代筋膜間充質(zhì)干細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸，用全自動細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，把細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至1.5×105/ml，以每孔200 μl 接種于96 孔板內(nèi)，96孔板周邊各孔中加入200 μl 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS），其中左側(cè)邊緣加入200 μl完全培養(yǎng)基，共接種6 塊96 孔板，置于37℃，5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日同一時間取1 塊96孔板，每孔加入水溶性甲臢化合物19 μl，吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate,PMS）1 μl，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4 h后取出96孔板，于酶標(biāo)儀中測定490 nm處的吸光度(A)，取96 孔A 的平均值，以A 為縱坐標(biāo)，時間（d）為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.6 筋膜源性干細(xì)胞表面免疫表型鑒定

取5 個1.5 ml 的離心管，每管中重懸第3 代的筋膜源性干細(xì)胞1×106，1000 r/min離心5 min，離心完成后棄上清，再次用50 μl的PBS重懸細(xì)胞，后將重懸的細(xì)胞懸液置于冰盒中，將適量PE 標(biāo)記的抗CD29（Thermo Fisher，25029180）、CD90（Thermo Fisher，12090081）抗體，F(xiàn)ITI 標(biāo)記的抗CD45（Thermo Fisher，11046180）抗體，APC 標(biāo)記的抗CD71（Thermo Fisher，17071082）抗體，分別用50 μl的PBS稀釋混勻后加入對應(yīng)的單細(xì)胞懸液中，其中空白對照組加入50 μl 的PBS，手指彈勻各管后，置于冰盒中避光孵育20 min，孵育后，各管中加入800 μl的PBS，1000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)此操作1 次，后用500 μl PBS 重懸后上機檢測，用NovoExpress軟件分析結(jié)果。

1.7 筋膜源性干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化

使用成脂誘導(dǎo)分化試劑盒，取第2 代的脂筋膜源性干細(xì)胞消化重懸，按2×104/cm2的細(xì)胞密度接種在12孔板中，均分為誘導(dǎo)分化組與未誘導(dǎo)分化組，誘導(dǎo)分化組每孔加入1 ml 完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔3 d 換液，直到細(xì)胞融合度達到100%或者過融合；吸走完全培養(yǎng)基后向六孔板中加入2 ml 誘導(dǎo)分化A 液，誘導(dǎo)3 d 后更換成誘導(dǎo)分化B液，24 h后換回A液進行誘導(dǎo)，A液和B 液交替作用3 次，繼續(xù)用B 液維持培養(yǎng)4 d，誘導(dǎo)分化完成；未誘導(dǎo)分化組采用常規(guī)完全培養(yǎng)基，吸走12孔板中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2遍，后每孔中加入1 ml的4%中性甲醛固定細(xì)胞20 min，固定完成后用PBS洗滌3遍，后每孔中加入油紅O 1 ml作用10 min，用PBS清洗3遍后在倒置相差顯微鏡下觀察。

1.8 筋膜源性干細(xì)胞的成軟骨誘導(dǎo)分化

取第3 代的軟骨細(xì)胞、筋膜源性干細(xì)胞消化計數(shù)，取27 個15 ml 離心管，9 個標(biāo)記為軟骨細(xì)胞組（A組），18個標(biāo)記為筋膜源性干細(xì)胞組，均分為B、C組，軟骨細(xì)胞組（A組）離心管中各重懸2×105個軟骨細(xì)胞，筋膜源性干細(xì)胞組（B、C）組離心管中各重懸2×105個筋膜源性干細(xì)胞，室溫下1000 r/min離心5 min，離心機半徑為15 cm，棄上清，軟骨細(xì)胞組（A組）用5 ml常規(guī)完全培養(yǎng)基重懸，筋膜源干細(xì)胞組（B、C組）用5 ml的成軟骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，各組再次室溫下1000 r/min 離心5 min，離心機半徑為15 cm，棄上清后，軟骨細(xì)胞組（A組）、筋膜源性干細(xì)胞C組用0.5 ml常規(guī)完全培養(yǎng)基重懸，筋膜源性干細(xì)胞B組用0.5 ml的誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（TGF-β3 10 ng/ml，BMP4 100 ng/ml）重懸[9,10]，再次室溫下1000 r/min離心5 min，離心機半徑為15 cm，保留培養(yǎng)基，擰松各離心管蓋子，垂直放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，每隔2 d 更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，于誘導(dǎo)分化的第28 天收取培養(yǎng)的細(xì)胞團塊，獲取的細(xì)胞團塊用4%中性甲醛固定24 h，24 h后用尺子測量所獲取的細(xì)胞團塊大小，并進行統(tǒng)計分析，測量后用被酒精浸泡過的擦鏡紙包裹細(xì)胞團塊，置于包埋盒中，伊紅染液中浸泡1 min，用PBS清洗2 遍后進行梯度脫水（75%、85%、95%、100%乙醇溶液各5min）、透明、浸蠟、包埋等步驟。將包埋好的細(xì)胞團塊6°冷臺預(yù)冷，調(diào)整切片機層厚為4 μm 進行切片，切片后做免疫組化染色，通過Image J軟件進行對3D pellet 切片進行免疫組化顯色后的半定量分析，以經(jīng)鑒定培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞作為對照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)用Levene檢驗方法進行方差齊性分析，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA），對方差分析有意義者行Bonferroni 法進行兩兩比較，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

筋膜源性干細(xì)胞分離接種后48 h，可見細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞呈多角形、長梭形，原代細(xì)胞在7 d 達到70%融合，細(xì)胞傳代后成漩渦狀生長，3 d達90%融合（圖1）。

分離培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞呈圓球形，懸浮狀態(tài)，接種后24 h 開始貼壁，48 h 大部分貼壁伸展，呈多角形、短梭形、三角形，72 h 大部分貼壁，分裂增殖加快。約8 d 匯合成單層鋪滿整個培養(yǎng)皿底面。傳代后生長速度加快，約4 d 左右即可傳代，細(xì)胞周圍可見具有折光性的細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞長成一片呈明顯鋪路石樣外觀（圖1）。

圖1 分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及筋膜源性干細(xì)胞的生長曲線

2.2 筋膜源性間充質(zhì)干細(xì)胞的生長動力學(xué)分析

根據(jù)生長曲線圖可見，第3代與第5代間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力差別不大，一般有2 d左右的潛伏期，隨即進入對數(shù)生長期，5～7 d后進入平臺期。第7代細(xì)胞的增殖能力較前代降低，在5～6 d進入平臺期（圖1）。

2.3 筋膜源性干細(xì)胞表面免疫表型特征

間充質(zhì)干細(xì)胞表達CD29、CD44、CD71、CD90 等基質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志抗原，而不表達CD34、CD45、CD14 等特異性表面抗原。此次選擇CD29、CD45、CD71、CD90 進行流式細(xì)胞儀檢測，其中，筋膜源性干細(xì)胞表面CD29 呈陽性表達、筋膜源性干細(xì)胞表面CD71呈陽性表達、筋膜源性干細(xì)胞表面CD90 呈陽性表達，而筋膜源性干細(xì)胞表面CD45呈陰性表達，這一結(jié)果也顯示了分離的筋膜細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性（圖2）。

2.4 筋膜源性干細(xì)胞的成脂肪誘導(dǎo)分化

誘導(dǎo)分化12 d 后可見部分細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)透亮的微小折光性好的顆粒，并且相互融合，經(jīng)油紅O 染色后呈現(xiàn)紅色（圖3）。

2.5 筋膜源性干細(xì)胞的成軟骨誘導(dǎo)分化

3D pellet培養(yǎng)后，筋膜源性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化組隨著誘導(dǎo)時間的延長，pellet 變圓，變白，形成的團塊形狀與軟骨細(xì)胞相近，而未經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)的筋膜源性干細(xì)胞pellet 小球，較小且無光澤（圖4A～C）；軟骨細(xì)胞組和筋膜源性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化組的細(xì)胞團塊經(jīng)石蠟切片后進行軟骨標(biāo)志物Ⅱ型膠原蛋白免疫組化顯色，顯微鏡下顯示：Ⅱ型膠原蛋白含量豐富，軟骨細(xì)胞數(shù)量較多，團塊邊緣連續(xù)、清晰，而單純的筋膜源干細(xì)胞組顯微鏡下顯示其軟骨細(xì)胞稀疏，II型膠原蛋白含量低，細(xì)胞團塊邊緣連續(xù)性差、清晰度低（圖4）。3個細(xì)胞組的細(xì)胞團塊直徑之間的差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.07，P=0.0004），進一步兩兩比較，軟骨細(xì)胞組與筋膜源性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化組的細(xì)胞團塊直徑之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），軟骨細(xì)胞組與筋膜源性干細(xì)胞組、筋膜源性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化組與筋膜源性干細(xì)胞組的細(xì)胞團塊直徑差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。隨后對各組pellet 的石蠟切片用免疫組織化學(xué)法檢測Ⅱ型膠原蛋白的表達，并用Image J 對各組結(jié)果分析，軟骨細(xì)胞組平均光密度值大于筋膜源性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化組、筋膜源性干細(xì)胞組（P＜0.05），筋膜源性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化組平均光密度值大于筋膜源性干細(xì)胞組（P＜0.05，表1）。

圖2 筋膜源性干細(xì)胞免疫表型的單參數(shù)直方圖

圖3 光鏡下成脂肪誘導(dǎo)分化的筋膜源性干細(xì)胞

3 討論

當(dāng)前，組織工程技術(shù)的發(fā)展突飛猛進，但在骨與關(guān)節(jié)疾病方面組織工程細(xì)胞的來源相對比較局限，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、滑膜干細(xì)胞是應(yīng)用相對較多的種子細(xì)胞[8,11-13]。但在取材和分離方面風(fēng)險較多，為利用帶來了諸多難題[14-16]。

圖4 3D pellet 培養(yǎng)至28 d的3組細(xì)胞團塊大體觀及細(xì)胞團塊石蠟切片后進行軟骨標(biāo)識物Ⅱ型膠原蛋白免疫組化顯色在40倍和200倍的顯微鏡下觀

間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎是一種新的選擇，骨髓基質(zhì)細(xì)胞、滑膜基質(zhì)細(xì)胞、骨膜分離的細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等在體外成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中均可以見到軟骨組織的形成[17,18]，但由于成分復(fù)雜，純化起來相對困難；間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取到應(yīng)用相對受限，本研究從大鼠的骨骼肌筋膜中分離出筋膜源性細(xì)胞，通過體外3D pellet培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中添加BMP4和TGF-β3進行體外誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)下形成透明的軟骨組織，在外觀上與正常軟骨組織接近，形成的軟骨組織經(jīng)軟骨細(xì)胞特異性Ⅱ型膠原蛋白的免疫組化檢測，糖胺聚糖的番紅O 染色、阿爾新蘭染色均顯示軟骨形成的特性，且筋膜源性細(xì)胞表達CD29、CD90、CD71，而不表達CD45，本研究證實了從骨骼肌筋膜分離出的非肌源性細(xì)胞具有成軟骨分化的能力，筋膜源性細(xì)胞與從骨骼肌中分離的肌源性干細(xì)胞不同，筋膜源性表達間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子，而極少表達內(nèi)皮細(xì)胞表面分子；筋膜源性細(xì)胞從包裹骨骼肌的筋膜中很容易分離，這也使得其成為軟骨修復(fù)可能的間充質(zhì)干細(xì)胞來源。間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎的機制目前還沒有得到充分的解釋[19,20]，目前廣泛接受的合理解釋有2個方面，其一是移植的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為軟骨細(xì)胞并充填于軟骨缺損處[21]，其二是移植的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過旁分泌方式分泌一些細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)腔的微環(huán)境[22-26]。筋膜源性干細(xì)胞的取材來源較廣，分離難度及風(fēng)險相對較低，有較強的成軟骨分化能力，且體外培養(yǎng)時具有較強的增殖能力，這為其日后進行軟骨修復(fù)提供了可能，也為體外大量擴增培養(yǎng)提供可能。

表1 各組細(xì)胞團平塊均直光徑密和度石值.（蠟n切=9片，x免±s）疫組織化學(xué)染色

目前將間充質(zhì)干細(xì)胞與其他相關(guān)生物材料或生物制劑結(jié)合治療骨關(guān)節(jié)炎已成為越來越引人注目的研究方向，例如將間充質(zhì)干細(xì)胞與生物支架或生物材料相結(jié)合協(xié)同治療骨關(guān)節(jié)炎[27]；間充質(zhì)干細(xì)胞以不同種類、不同比例搭配混合治療骨關(guān)節(jié)炎[28]；以及間充質(zhì)干細(xì)胞與富含血小板的血漿協(xié)同改善骨關(guān)節(jié)炎等[29]，間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)體現(xiàn)出了其在骨關(guān)節(jié)炎治療上的前景，而在臨床實踐中廣泛使用之前,仍有許多問題需要解決，這要求科研工作者們繼續(xù)發(fā)掘?qū)Ρ炔煌瑏碓吹拈g充質(zhì)細(xì)胞及其效果[30]，筋膜源性干細(xì)胞的分離和鑒定正與此要求相符，為其提供了另一種選擇及新的研究思路，豐富了細(xì)胞治療骨與關(guān)節(jié)疾病的細(xì)胞來源，在組織工程中具有很大的應(yīng)用前景。