重慶市河水中糞源微生物污染特征及源解析

張麟杰,王淦淦,張利蘭*,阮雪吟,周紹宏,張代鈞,趙 琳,王鵬飛

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重慶市河水中糞源微生物污染特征及源解析

張麟杰1,2,王淦淦2,張利蘭1,2*,阮雪吟2,周紹宏2,張代鈞1,趙 琳2,王鵬飛2

(1.重慶大學(xué)煤礦災(zāi)害動(dòng)力學(xué)與控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400044；2.重慶大學(xué)資源及環(huán)境科學(xué)學(xué)院環(huán)境科學(xué)系,重慶 400044)

以重慶主要河流水體作為研究對(duì)象,使用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)評(píng)估了細(xì)菌總數(shù)、糞鏈球菌、腸球菌、脆弱擬桿菌、總大腸菌群及糞大腸菌群的污染水平;同時(shí)以擬桿菌作為特異性指示菌,選取人源性糞便專一指示菌引物(HF183)和豬源性糞便專一指示菌引物(Pig-2-Bac)進(jìn)行源追蹤.微生物培養(yǎng)結(jié)果表明:重慶市主要河流在春季有15.4%的研究斷面未達(dá)到III類水質(zhì),秋季有61.5%的研究斷面未達(dá)到III類水質(zhì).在春季,主城區(qū)河流主要受人類糞便污染,區(qū)縣河流主要受動(dòng)物糞便污染;在秋季,主城區(qū)和區(qū)縣河流都主要受人類糞便污染.指示微生物指標(biāo)間Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明糞鏈球菌、糞大腸菌群、腸球菌兩兩之間有顯著相關(guān)性,腸球菌與脆弱擬桿菌有顯著相關(guān)性.豬源性擬桿菌特異性生物標(biāo)記Pig-2-Bac和人源擬桿菌特異性生物標(biāo)記HF183對(duì)人和動(dòng)物糞便污染區(qū)分成功率達(dá)100%;用這兩種特異性引物對(duì)春季水樣DNA進(jìn)行擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)13個(gè)采樣點(diǎn)均未受到豬源糞便污染, 唐家沱、朝天門、雞冠石、合川受到人源糞便污染.

糞源性微生物；微生物溯源；擬桿菌；主要河流；重慶市

水污染是關(guān)乎人類健康的最大問題之一,據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查,80%的人類疾病與水質(zhì)污染有關(guān).以往研究人員對(duì)水體的監(jiān)測大多集中于有機(jī)污染物、重金屬等,對(duì)微生物指標(biāo)的監(jiān)測較少.

河流水體中微生物污染很大程度上來自人類和動(dòng)物排泄的各種病原微生物,但河流中微生物通常種類較多,數(shù)量較少,對(duì)每一種微生物進(jìn)行監(jiān)測十分困難,所以各國通常檢測適當(dāng)?shù)奈⑸镏笜?biāo)來評(píng)估水體中微生物污染狀況,以及對(duì)人類健康的風(fēng)險(xiǎn).一般選用糞便指示菌代替致病菌對(duì)水體微生物進(jìn)行研究[1].目前較多國家仍采用應(yīng)用較早的總大腸菌群與糞大腸菌群,但美國環(huán)保局、歐盟及WHO等推薦選用腸球菌和大腸桿菌指示糞便污染[2-4].我國現(xiàn)行的地表水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002)[5]中微生物指標(biāo)僅有糞大腸菌群,忽視了對(duì)其他微生物指標(biāo)的檢測,導(dǎo)致我國河流病原性微生物污染情況不明,不利于流域的公共衛(wèi)生安全管理.

“微生物溯源”最早由Hagedorn等提出,是指通過比較污染樣品與可疑污染源中的糞便污染指示微生物的差異或其生物標(biāo)記的有無來判斷污染樣品與可疑污染源之間的聯(lián)系,從而確定其可能的污染來源[6].溯源方法可分為培養(yǎng)建庫微生物溯源和非培養(yǎng)建庫微生物溯源.培養(yǎng)建庫微生物溯源需要建立一個(gè)龐大的污染源數(shù)據(jù)庫,但建立數(shù)據(jù)庫耗時(shí)耗力,成本高,而且只適合在固定的小范圍區(qū)域內(nèi)進(jìn)行溯源.而非培養(yǎng)建庫微生物溯源有效克服了這些弱點(diǎn),直接通過檢測宿主特異性的標(biāo)記來追蹤不同的糞便污染源,靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速.常用方法有擬桿菌生物標(biāo)記法、大腸桿菌生物標(biāo)記法、線粒體示蹤技術(shù)等.歐美等發(fā)達(dá)國家已開展了相關(guān)研究工作,并取得了積極的進(jìn)展[7-9],我國在這方面的研究起步較晚.其中,擬桿菌在眾多的指示菌中受到了更多的關(guān)注,并成為定量化溯源研究的常用指示微生物.研究表明豬源性擬桿菌特異性生物標(biāo)記Pig-2-Bac[10]和人源性擬桿菌特異性生物標(biāo)記HF183[11]特異性良好,可作為有效的溯源工具[12-13].

重慶是長江上游重要的工業(yè)城市和經(jīng)濟(jì)中心,主要河流有長江、嘉陵江,居民的生活用水、景觀用水、娛樂用水都取自于這兩大河流,同時(shí)重慶市處于三峽水庫上游,境內(nèi)水庫占三峽庫區(qū)的70%[14],其水質(zhì)安全與重慶市和水庫下游居民健康息息相關(guān).

因此,本研究選取長江重慶段(江津至豐都段)、嘉陵江重慶段(合川至朝天門)為研究對(duì)象,利用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)對(duì)糞源性微生物進(jìn)行培養(yǎng),客觀評(píng)價(jià)水體中糞源性微生物的污染現(xiàn)狀,首先,通過對(duì)重慶主要河流水體樣本進(jìn)行微生物培養(yǎng)、確定其中糞源性微生物的濃度,為重慶市地表水的糞源微生物污染濃度水平提供參考數(shù)據(jù).其次,利用非培養(yǎng)建庫微生物溯源的方法,以擬桿菌作為指示微生物,追蹤各流域段糞便污染的主要來源,可為qPCR技術(shù)定量檢測環(huán)境水體中糞源的污染累積研究資料,加快微生物溯源技術(shù)在我國水體污染定位中的應(yīng)用.

1 材料與方法

1.1 水樣采集

圖1 水樣采樣點(diǎn)的分布 Fig.1 The map of water sampling sitesA至M依此代表唐家沱、朝天門、雞冠石、合川、北碚、童家溪、江津、西彭、涪陵、豐都、長壽、魚嘴、井口

選取長江重慶段(江津至豐都段)、嘉陵江重慶段(合川至朝天門)為研究對(duì)象,在四月上旬和九月下旬進(jìn)行采樣.共設(shè)13個(gè)采樣點(diǎn),均采取表層水,使用10L聚乙烯采樣桶,采樣量為采樣瓶的80%左右,以便能充分混合振搖樣品.水樣的pH值、溫度及溶氧值分別使用便攜式pH計(jì)、溫度計(jì)、溶解氧測定儀進(jìn)行現(xiàn)場測定.樣品在4℃下運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,并立即做微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),同時(shí)使用0.22μm的微孔濾膜過濾一定量的水樣,將濾膜貯存在-20℃冰箱中供后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn).采樣點(diǎn)的分布及詳細(xì)信息如圖1.

1.2 監(jiān)測指標(biāo)與方法

本研究監(jiān)測了細(xì)菌總數(shù)(Total bacteria)、糞鏈球菌()、腸球菌(ENT)、脆弱擬桿菌()、總大腸菌群(TC)和糞大腸菌群(FC)6種指示微生物,同時(shí)也監(jiān)測了pH值、溫度、溶解氧等常規(guī)理化性質(zhì).前4種指示菌結(jié)果用CFU/mL表示,后2種指示菌結(jié)果用MPN/mL表示.指示微生物所用培養(yǎng)方法如表1所示.

表1 微生物培養(yǎng)材料及方法Table 1 Meterials and methods of microbial culturing

1.3 非培養(yǎng)建庫微生物溯源技術(shù)追蹤水體中糞源性微生物來源

選擇源特異性引物(豬源性擬桿菌特異性生物標(biāo)記Pig-2-Bac[10]、人源性擬桿菌特異性生物標(biāo)記HF183[11]進(jìn)行水體中糞源性微生物溯源.首先,采集長壽紅豬業(yè)養(yǎng)殖場豬的糞便樣品用于豬源性Bac41F/Bac163Rm引物的驗(yàn)證,在重慶市腫瘤醫(yī)院采集人體糞便樣品(無腸道疾病的人群)用于人源性HF183引物的驗(yàn)證.并利用豬糞便和人體糞便對(duì)兩種特異性引物進(jìn)行交叉驗(yàn)證. Pig-2-Bac的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃,5min;變性95℃,30s, 60℃退火,30s,72℃延伸,30s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min.采用不加模板DNA的體積作為陰性對(duì)照. HF183的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃,4min;變性94℃,30s,35循環(huán);退火60℃,1min; 72℃延伸2min;另外72℃再延伸10min.采用不加模板DNA的體積作為陰性對(duì)照.驗(yàn)證后,用OMEGA水樣DNA提取試劑盒提取水體中的總DNA,并使用已驗(yàn)證的特異性引物對(duì)提取的水體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,追蹤糞源性微生物來源.

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究獲取原始數(shù)據(jù)后,利用Origin2017軟件進(jìn)行處理并作圖,利用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析,獨(dú)立樣本檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 理化性質(zhì)

對(duì)13個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行理化性質(zhì)的測定結(jié)果為:水樣溫度介于21.1~25.0℃之間;水樣pH值介于7.95~ 8.25之間;春季水樣溶解氧濃度介于6.90~9.97mg/L之間,秋季介于2.85~7.65mg/L.

2.2 指示微生物濃度水平

2.2.1 微生物污染狀況評(píng)價(jià) 13個(gè)采樣點(diǎn)春秋兩季、6種糞源性微生物的濃度如圖2所示,細(xì)菌總數(shù)的濃度范圍在2.4×102~7.4×104CFU/mL之間,糞鏈球菌在0.20~30.84CFU/mL之間,腸球菌濃度在0.24~5.30CFU/mL之間,脆弱擬桿菌在1.52~ 43.49CFU/mL之間,糞大腸菌群濃度在未檢出~ 54MPN/mL,總大腸菌群濃度在未檢出~92MPN/mL (未測秋季的總大腸菌群數(shù)量) ,各指示微生物在不同的采樣點(diǎn)之間差異顯著.

我國地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002)[5]規(guī)定,III類、IV類、V類水質(zhì)的糞大腸菌群濃度限值依次為10000,20000,40000CFU/L.依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn),在春季80%的研究斷面都達(dá)到III類水標(biāo)準(zhǔn)及以上,A唐家沱段和B朝天門段污染嚴(yán)重,是V類水質(zhì).在秋季只有38.5%的研究斷面達(dá)到III類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)及以上,有38.5%的研究斷面是V類水質(zhì)或劣V類水質(zhì).D合川段、F童家溪段和M井口段污染特別嚴(yán)重,是劣V類水質(zhì)(如圖2(e)所示).

美國環(huán)保署于2012年發(fā)布了娛樂水體水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[2],該標(biāo)準(zhǔn)推薦了腸球菌和大腸桿菌作為指示菌指示淡水受到糞便污染的狀況.標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定:置信區(qū)間為90%時(shí),腸球菌濃度￡130CFU/100mL.以該標(biāo)準(zhǔn)衡量研究水體糞便污染程度,春季有38.5%的研究斷面(A、B、D、H、M)的腸球菌濃度超標(biāo),秋季有38.5%的研究斷面超標(biāo)(B、D、E、F、M).(如圖2(c)所示).

A、C兩個(gè)采樣點(diǎn)分別臨近唐家沱污水處理廠及雞冠石污水處理廠,大部分指示微生物的濃度在唐家沱段均高于雞冠石段,且唐家沱段的糞大腸菌群和腸球菌都超過了標(biāo)準(zhǔn)限值.雞冠石和唐家沱污水處理廠為重慶市兩大主要污水處理廠,且雞冠石污水處理廠處理量大于唐家沱.除脆弱擬桿菌外,其他糞源性指示微生物濃度在朝天門都處于較高濃度.朝天門位于嘉陵江與長江交匯處,有重慶最大的水碼頭,兩江交匯這一特殊水文特征可能使微生物大量繁殖,且朝天門作為重慶市的著名景點(diǎn),碼頭處來往的輪船和游客也會(huì)帶來一定程度的糞便污染.而擬桿菌是專性厭氧桿菌,在天然水體中存活時(shí)間短且不能繁殖[16-17].此外,井口段的腸球菌和脆弱擬桿菌均處于濃度相對(duì)較高的水平,井口段臨近井口污水處理廠及重慶市腫瘤醫(yī)院,且取樣點(diǎn)附近有散排污水管道,可能使此段水體中糞源微生物水平上升.

2.2.2 指示微生物時(shí)空分布特征 以春秋兩季為時(shí)間尺度,以主城區(qū)流域和區(qū)縣流域?yàn)榭臻g尺度,探究指示微生物的分布特征.結(jié)果如表2所示.在春季,糞鏈球菌、腸球菌、糞大腸菌群、總大腸菌群在主城區(qū)流域的平均濃度明顯高于區(qū)縣流域的平均濃度.在秋季,糞鏈球菌、腸球菌、糞大腸菌群在主城區(qū)流域的平均濃度明顯高于區(qū)縣流域的平均濃度.主城區(qū)人類活動(dòng)密集,排放大量生活污水,導(dǎo)致主城區(qū)流域糞源性微生物多余區(qū)縣流域.

將春季和秋季共有的微生物指標(biāo)進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn),在置信水平為95%的情況下,發(fā)現(xiàn)糞大腸菌群有顯著性差異,秋季的糞大腸菌群遠(yuǎn)高于春季的糞大腸菌群.其余指示微生物均無顯著性差異.可能由于秋季多雨,上游來水加大,并且三峽水庫開始蓄水等多種因素,造成了重慶市流域秋季的糞大腸菌群遠(yuǎn)比春季多[18].

表2 指示微生物的平均濃度Table 2 The average concentration of indicator microorganism

2.3 指示微生物指標(biāo)間的相關(guān)性分析

因?yàn)樗w中指示微生物通常符合對(duì)數(shù)正態(tài)分布,故先將指示微生物濃度取對(duì)數(shù)(除FC外),再進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,分析結(jié)果如表3所示.糞鏈球菌與FC具有顯著的相關(guān)性,這與段逸凡[19]得到的結(jié)果是一致的.腸球菌與FC有顯著的相關(guān)性,這與王江權(quán)等[20]的研究結(jié)果是一致.

表3 指示微生物指標(biāo)間Pearson相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation analysis among indicators of microbial indicators

注:括號(hào)外為相關(guān)系數(shù),括號(hào)內(nèi)為相關(guān)性檢驗(yàn)的sig值,當(dāng)sig￡0.05時(shí),則認(rèn)為相關(guān)性顯著.**在0.01水平上顯著相關(guān).

宮月華[21]的研究結(jié)果表明細(xì)菌總數(shù)與FC、細(xì)菌總數(shù)與腸球菌有顯著的相關(guān)性,但本研究并未發(fā)現(xiàn)二者有相關(guān)性.不同水體環(huán)境中的微生物之間的相關(guān)性不一定相同,微生物之間的相關(guān)性不能夠任意推廣,需要結(jié)合具體的研究環(huán)境.

2.4 指示微生物和理化指標(biāo)之間的相關(guān)性

將秋季的指示微生物濃度取對(duì)數(shù)后與水溫、pH值、DO等理化指標(biāo)做相關(guān)性分析,得到結(jié)果如表4所示.腸球菌與pH值、ORP具有相關(guān)性,脆弱擬桿菌與NH4+-N具有相關(guān)性,糞大腸菌群與pH值、ORP、NH4+-N具有相關(guān)性.秋季與春季水體性質(zhì)差異是決定FC濃度存在差異(表2)的主要原因之一.

表4 指示微生物和理化指標(biāo)之間的相關(guān)性 Table 4 Correlation between the five fecal indicator bacteria and other water quality indexe

注:括號(hào)外為相關(guān)系數(shù),括號(hào)內(nèi)為相關(guān)性檢驗(yàn)的sig值,當(dāng)sig￡0.05時(shí),則認(rèn)為相關(guān)性顯著.*在0.05水平上顯著相關(guān).

2.5 污染源解析

2.5.1 污染源簡析 基于人體和動(dòng)物體內(nèi)FC和FS的比例不同,《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[22]提供了使用FC/FS比值區(qū)分糞便污染的來源的方法.FC/FS34時(shí),為人類糞便;FC/FS￡0.7時(shí),為溫血?jiǎng)游锛S便;2

表5 主城區(qū)和區(qū)縣的FC/FS的值Table 5 The value of FC/FS in central and district

圖3 糞源性微生物PCR檢測結(jié)果 Fig.3 PCR test results of fecal microorganismsA至M依此代表唐家沱、朝天門、雞冠石、合川、北碚、童家溪、江津、西彭、涪陵、豐都、長壽、魚嘴、井口

2.5.2 引物特異性驗(yàn)證結(jié)果 使用PCR條件優(yōu)化過程中確定的最佳退火溫度,對(duì)豬糞DNA和人糞DNA進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證(=10),引物特異性驗(yàn)證結(jié)果表明,豬源性Pig-2-Bac在豬糞便樣品、人源性HF183引物在人體糞便樣品中的擴(kuò)增效率均達(dá)到80%以上,片段大小都與文獻(xiàn)所述一致.交叉驗(yàn)證證明豬糞便中未檢出人源性擬桿菌(HF183),人體糞便中未檢出豬源性擬桿菌.故通過驗(yàn)證說明豬源性Pig-2-Bac引物和人源性HF183可以成功的區(qū)分人體糞便污染和豬糞便污染.

2.5.3 環(huán)境水樣糞源性微生物溯源結(jié)果 分別采用豬源引物(Pig-2-Bac)和人源引物(HF183),對(duì)取自于春季的13個(gè)采樣點(diǎn)的水體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示.在豬源擴(kuò)增中,13個(gè)采樣點(diǎn)均未出現(xiàn)目的條帶,說明這些采樣點(diǎn)都未受到豬源糞便污染,但有可能被雞、牛等糞便源污染.人源性擬桿菌特異性檢測結(jié)果顯示:A唐家沱、B朝天門、C雞冠石、D合川均受到人源性糞便污染,其中,唐家沱、朝天門污染嚴(yán)重,這與春季糞源性微生物培養(yǎng)結(jié)果一致.證明此兩個(gè)地區(qū)受人類糞便污染嚴(yán)重,應(yīng)引起環(huán)境管理部門重視.

3 結(jié)論

3.1 重慶市主要河流中細(xì)菌總數(shù)的濃度范圍在102~105CFU/mL之間,糞鏈球菌、腸球菌和脆弱擬桿菌在10-1~102CFU/mL之間,糞大腸菌群濃度在未檢出~102MPN/mL之間. 根據(jù)我國地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002)[5]判斷,春季有15.4%的研究斷面未達(dá)到III類水質(zhì),秋季有61.5%的研究斷面未達(dá)到III類水質(zhì).

3.2 通過糞大腸菌群/糞鏈球菌比值初步判斷:在春季,主城河流主要受人類糞便污染,區(qū)縣河流主要受動(dòng)物糞便污染.在秋季,主城區(qū)和區(qū)縣河流都受人類糞便污染.

3.3 重慶主城區(qū)的糞鏈球菌、腸球菌、糞大腸菌群的平均濃度均高于區(qū)縣的平均濃度;秋季的糞大腸菌群濃度與春季有顯著性差異.

3.4 利用豬源性擬桿菌特異性生物標(biāo)記Pig-2- Bac和人源擬桿菌特異性生物標(biāo)記HF183對(duì)春季水樣進(jìn)行非建庫微生物溯源,發(fā)現(xiàn)13個(gè)采樣點(diǎn)均未受到豬源糞便污染, 唐家沱、朝天門、雞冠石、合川受到人源糞便污染,其中,唐家沱、朝天門污染較為嚴(yán)重.

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致謝：本實(shí)驗(yàn)的現(xiàn)場采樣工作由重慶大學(xué)資源及環(huán)境科學(xué)學(xué)院博士研究生韓新寬、碩士研究生李家寧、段林豐等協(xié)助完成,在此表示感謝.

Pollution characteristics and source track of fecal microorganism in the rivers across Chongqing city.

ZHANG Lin-jie1,2, WANG Gan-gan2, ZHANG Li-lan1,2*, RUAN Xue-yin2, ZHOU Shao-hong2, ZHANG Dai-jun1, ZHAO Lin2, WANG Peng-fei2,

(1.State Key Laboratory of Coal Mine Disaster Dynamics and Control, Chongqing University, Chongqing 400044, China；2.Department of Environment Science, College of Resources and Environmental Science, Chongqing university, Chongqing 400044, China)., 2019,39(3)：1253~1260

In this study, 13 water samples were collected from the main stem rivers in Chongqing city. The numbers of total bacteria,, enterococci,, total coliforms andwere counted using traditional culturing techniques. The bacteroides were selected as specific indicator bacteria to identify the specific fecal pollution sources by using human-specific bacteroides maker (HF183) and pig-specific bacteroides maker (Pig-2-Bac). The results showed that 15.4% of the main stem river reaches in Chongqing did not reach category III water quality in spring, and 61.5% did not reach category III water quality in autumn. In spring, the rivers in the main urban areas were mainly polluted by human excrement, and those in the rural areas were mainly polluted by animal manure. In autumn, the main stem river reaches and the rivers in the rural areaswere polluted by human excrement. Pearson correlation analysis of indicator microorganisms showed that there were strong correlation between any two indicator of fecal streptococcus, fecal coliform and enterococci, and there was a significant correlation between enterococci and.The verification tests showed that pig source-specific biomarkers, pig-2-bac and human-specific markers, HF183, showed good specificity to pig manure and human feces samples, respectively. Using these two specific biomarkers to amplify DNA in water samples, it was found that in the spring all the 13 sampling sites were not contaminated by pig feces; four samples including Tangjiatuo, Chaotianmen, Jiguanshi and Hechuan were polluted by human feces.

fecal microorganisms；microbial source tracking；；main rivers；Chongqing

X522

A

1000-6923(2019)03-1253-08

張利蘭(1986-),女,河南南樂人,副教授,博士,主要從事水污染防護(hù)方面的研究.發(fā)表論文10余篇.

2018-08-27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41603109);重慶市基礎(chǔ)科研與前沿技術(shù)研究專項(xiàng)(cstc2017jcyjAX0362);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(106112016CDJXY240001,106112017CDJQ218844);重慶市留學(xué)回國人員創(chuàng)新資助項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目

* 責(zé)任作者, 副教授, lilanzhang@cqu.edu.cn