菌糠強(qiáng)化微生物降解石油污染土壤修復(fù)研究

張博凡,熊 鑫,韓 卓,張秀霞*,劉澤陽,馬 年,劉會(huì)娥,顧瑩瑩

?

菌糠強(qiáng)化微生物降解石油污染土壤修復(fù)研究

張博凡1,熊 鑫1,韓 卓2,張秀霞1*,劉澤陽1,馬 年1,劉會(huì)娥1,顧瑩瑩1

(1.中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院,山東 青島 266580；2.勝利油田分公司技術(shù)檢測中心,山東 東營 257000)

采用菌糠協(xié)同高效石油烴降解菌.sp.Q2進(jìn)行石油污染土壤修復(fù)試驗(yàn)研究,分別設(shè)置菌糠固定化微生物組(SIM)、菌糠-游離菌組(SMSB)、菌糠單獨(dú)組(SMS)和對(duì)照組(CK)4組修復(fù)實(shí)驗(yàn). 考察不同處理方式下對(duì)石油污染土壤微生物數(shù)量、酶活性和石油烴降解效果的差異性并確定石油污染土壤的最佳修復(fù)方案. 結(jié)果表明:不同修復(fù)方式下,SIM組的土壤呼吸強(qiáng)度、微生物數(shù)量及酶活性較其他組有明顯提高,其對(duì)石油烴去除率分別比其他3組提高11.84%、22.15%、54.09%.土壤中脫氫酶活性以及微生物活性與石油烴降解率的相關(guān)性顯著,此外菌糠固定化微生物對(duì)石油污染土壤修復(fù)具有生物強(qiáng)化和生物刺激協(xié)同的作用機(jī)制.

菌糠；固定化微生物；土壤修復(fù)；石油烴降解

近年來,石油行業(yè)得到了蓬勃的發(fā)展,在對(duì)石油的勘探、開發(fā)、儲(chǔ)運(yùn)與加工及使用過程中,原油和原油制品跑、冒、滴、漏等造成采油區(qū)和煉廠附近大面積土壤污染[1].固定化微生物技術(shù)克服了傳統(tǒng)方法修復(fù)過程中的缺點(diǎn)[2],不僅可以提高菌密度,還有利于屏蔽環(huán)境的毒害作用,增強(qiáng)外源菌競爭優(yōu)勢,提高降解效率,在石油污染土壤治理領(lǐng)域中應(yīng)用越來越廣泛[3-4].

菌糠是收獲食用菌后廢棄的培養(yǎng)基質(zhì),據(jù)統(tǒng)計(jì)每出產(chǎn)1kg食用菌約產(chǎn)生5kg菌糠,每年約有8000多萬t廢棄菌糠通過焚燒、填埋等方式處理,不僅占用了大量土地,燃燒過程中還會(huì)產(chǎn)生甲烷等溫室氣體或有毒化合物(如二噁英)等.研究發(fā)現(xiàn)菌糠中富含有機(jī)質(zhì)、鉀、鈣、鎂、氮、磷以及銅、鋅、鐵等多種營養(yǎng)元素,加工處理后可用于作物肥料和土壤調(diào)理劑[5],同時(shí)其結(jié)構(gòu)疏松多孔,表面較粗糙,含有較多官能團(tuán)和真菌菌絲體,能夠分泌漆酶、錳過氧化物酶等,可以吸附染料、重金屬、石油烴等多種污染物質(zhì)[6],改善土壤肥力.

目前,對(duì)于農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用,將其作為載體材料固定化微生物,在修復(fù)有機(jī)污染物方面取得了一定成效[7-8],但由于其只具備單一的吸附性能,降解有機(jī)物能力相對(duì)較弱.而菌糠不僅可以作為微生物載體,又可以通過細(xì)菌-真菌-酶體系強(qiáng)化降解有機(jī)污染物[9-10],發(fā)揮雙向優(yōu)勢,提高污染物去除效率,因此探究菌糠的綜合資源化利用方式處理環(huán)境污染問題值得探討.

將菌糠與高效石油烴降解菌結(jié)合,通過花盆實(shí)驗(yàn)?zāi)M菌糠固定化微生物、菌糠-游離菌以及菌糠單獨(dú)添加對(duì)石油污染土壤原位修復(fù),探究修復(fù)過程中對(duì)土壤呼吸強(qiáng)度、微生物數(shù)量、微生物區(qū)系以及土壤生態(tài)毒性的影響差異,確定最優(yōu)修復(fù)方式,為菌糠修復(fù)石油污染土壤的應(yīng)用提供一定的技術(shù)支撐和理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)土樣取自勝利油田0~20cm附近石油污染土壤,將土樣壓碎翻動(dòng)至松散,風(fēng)干后過篩,取40~80目之間的土壤,即去除較大雜質(zhì)和直徑過小的細(xì)土,篩分后的土壤于-20℃低溫冷凍保存.

新鮮菌糠選自山東青島天農(nóng)食用菌有限公司,初始濕重15%,過40目篩于-20℃低溫冷凍保存.

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)菌株Q2是以勝利油田污染土壤為菌源,勝利原油為唯一碳源篩選馴化所得土著菌,經(jīng)16S rDNA 生物分子學(xué)鑒定為sp.Q2,在原油質(zhì)量濃度為1000mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,微桿菌Q2 在7d內(nèi)對(duì)石油烴降解率為45.52%.

1.3 修復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽(pot experiment)模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)行石油污染土壤修復(fù)研究.用磷酸二氫鉀和硝酸鈉調(diào)節(jié)土壤C、N、P的質(zhì)量比為(C):(N):(P)=100:10:1,修復(fù)過程中可直接采用減重法調(diào)節(jié)各個(gè)花盆中的含水率,使之保持在18%左右[11].

試驗(yàn)分4組,每組3個(gè)平行,共12盆,每盆分別加入500g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.57%石油污染土壤,分別加入菌糠(SMSB)、菌糠-游離菌(SMS)、菌糠固定化微生物(SIM),其中一組為空白對(duì)照組(CK),將3個(gè)處理組樣品放于30℃、60% RH(Relative humidity,空氣相對(duì)濕度)的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中,每天光照10h,修復(fù)過程中每隔7d采樣測定各花盆中石油烴含量,土壤呼吸強(qiáng)度、微生物數(shù)量及土壤酶活性等指標(biāo),試驗(yàn)周期為45d.

1.4 土壤呼吸強(qiáng)度及微生物數(shù)量的測定

土壤呼吸強(qiáng)度采用堿液吸收法測定,稱取10g新鮮土壤于200mL燒杯中,其中插入含有5mLNaOH(2mol/L)溶液的小燒杯,置于30℃下密封培養(yǎng)24h,將溶液轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容,分別以酚酞和甲基橙為指示劑,用0.1mol/L HCl溶液滴定,根據(jù)消耗量計(jì)算出土壤呼吸產(chǎn)生CO2[mg/(kg×h)]的量.

采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測定微生物數(shù)量. 稱取5g土壤于盛有100mL無菌蒸餾水的錐形瓶中,充分振蕩后進(jìn)行逐級(jí)稀釋于培養(yǎng)基中涂布,牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基用于計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量,孟加拉紅培養(yǎng)基用于計(jì)數(shù)真菌數(shù)量. 將涂布好的培養(yǎng)基置于30±2.0℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后計(jì)數(shù).

采用DNA提取-PCR擴(kuò)增-DGGE電泳的分子生物學(xué)方法,在修復(fù)的第7d、第21d和第45d,分別采集4組盆栽中的土樣,提取其總DNA,對(duì)16SrDNA的V3可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物由變形梯度凝膠電泳(DGGE)進(jìn)行檢測,研究土壤的微生物區(qū)系動(dòng)態(tài)變化.

1.5 土壤生理生化參數(shù)及生態(tài)毒性測定

土壤中漆酶活性測定采用ABTS-紫外分光光度法,以檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH=4.5),于420nm波長下測定吸光度;錳過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚-紫外分光光度法,以磷酸為緩沖液(pH= 7.0),于470nm波長下測定吸光度,定義吸光度每分鐘變化0.01為一個(gè)酶活單位(U).

儲(chǔ)存在活細(xì)胞中的熒光素二乙酸酯(FDA)能夠被細(xì)菌以及酯酶等非專一性酶類水解,釋放出熒光素,因此FDA水解酶能夠較好反映土壤微生物活性以及土壤質(zhì)量的變化[12].脫氫酶是微生物呼吸過程中分泌的胞內(nèi)酶[13],它們與微生物種群密切相關(guān),對(duì)環(huán)境擾動(dòng)非常敏感.因此,考察這兩個(gè)指標(biāo)不僅可以表征土壤的生態(tài)毒性,還能從側(cè)面反應(yīng)污染物的降解效果.

其中FDA水解酶以熒光素二乙酸酯為底物,采用分光光度法于490nm處測定吸光度;脫氫酶活性采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)還原法于485nm處測定吸光度數(shù)值來表示酶活性大小.

1.6 土壤石油烴含量的測定

土壤中石油烴含量采用超聲-索氏萃取-重量法測定.具體步驟為準(zhǔn)確稱取5.00g土樣于離心管中,以二氯甲烷為萃取劑,振蕩,超聲萃取15min,重復(fù)3次,萃取結(jié)束后離心分離,將上清液倒入燒瓶,于54℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干且恒重,燒瓶前后質(zhì)量差即為石油烴含量.

1.7 土壤石油烴降解動(dòng)力學(xué)方程

一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程,土壤剩余石油烴含量時(shí)間變化動(dòng)力學(xué)模型回歸方程為:

式中:0為初始石油烴含量;為時(shí)間下石油烴含量;為修復(fù)時(shí)間;為微生物降解速率常數(shù).

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010和origin 9.0進(jìn)行處理和制圖,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤呼吸強(qiáng)度和微生物數(shù)量的變化

由圖1~3可以看出,隨著時(shí)間的延長,土壤呼吸強(qiáng)度以及細(xì)菌、真菌數(shù)量整體呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢.修復(fù)前期,土壤中營養(yǎng)物質(zhì)充足,生存環(huán)境適宜,經(jīng)短暫適應(yīng)期后外源降解菌數(shù)量在7~21d內(nèi)增加迅速,生長代謝旺盛,呼吸強(qiáng)度也明顯提高.30d左右時(shí),土壤中C、N、P等營養(yǎng)物質(zhì)減少,土壤氧化還原電位降低[14],同時(shí)石油烴分解過程可能會(huì)產(chǎn)生有毒中間產(chǎn)物對(duì)微生物有毒害作用,導(dǎo)致細(xì)菌、真菌數(shù)量減少,微生物呼吸強(qiáng)度減弱[15].但總體來看,添加菌糠能夠顯著提高土壤中微生物數(shù)量和活性.

圖1 土壤呼吸強(qiáng)度隨修復(fù)時(shí)間的變化 Fig.1 Variation of soil respiration intensity with remediation time

土壤呼吸強(qiáng)度、微生物量是一個(gè)重要的土壤生態(tài)指標(biāo)[16]. 4組盆栽實(shí)驗(yàn)中,菌糠固定化微生物組(SIM)中的細(xì)菌及真菌數(shù)量最多,可達(dá)7.94× 107CFU/g土,22.38×104CFU/g土,土壤呼吸強(qiáng)度為41.95mg CO2/(kg×h). 3項(xiàng)指標(biāo)整體均呈現(xiàn)SIM> SMSB>SMS>CK趨勢.在菌糠和細(xì)菌共存體系中,菌糠中的真菌通過產(chǎn)生菌絲體和孢子的方式生長形成伸展的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),為細(xì)菌遷移提供通道,強(qiáng)化了細(xì)菌生長,推遲了衰亡期,真菌-細(xì)菌共存具有協(xié)同促進(jìn)作用,因此SIM、SMSB組微生物活性高于SMS組.其次,與游離菌組相比,菌糠自身豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以及疏松多孔的特性,不僅可以滿足微生物生長代謝繁殖,還能夠屏蔽不良土壤環(huán)境、增強(qiáng)外源菌與土著菌的競爭作用,進(jìn)而提高石油烴攝取及降解能力.

圖2 土壤細(xì)菌數(shù)量隨修復(fù)時(shí)間的變化 Fig.2 Variation of amount of bacteria in soil with remediation time

圖3 土壤真菌數(shù)量隨修復(fù)時(shí)間的變化 Fig.3 Variation of amount of fungi in soil with remediation time

由圖4可以看出,每種土樣的總DNA的V3可變區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果均有多條亮帶,且條帶的亮度均較強(qiáng),說明檢測的土樣中含有多種微生物.修復(fù)7d的土樣有一個(gè)明顯的亮帶,可認(rèn)為是修復(fù)初期加入的外源降解菌群成為優(yōu)勢菌種造成的;修復(fù)45d后,所有土樣中的外源降解菌群亮帶的亮度均逐漸減弱,說明外源降解菌數(shù)量隨著修復(fù)時(shí)間而減少[17],這一趨勢與上述土壤呼吸強(qiáng)度和微生物數(shù)量變化規(guī)律相符合,隨著修復(fù)進(jìn)行,土壤整體營養(yǎng)狀況、微生物生存環(huán)境變差,同時(shí)由于土著微生物的競爭作用,導(dǎo)致外源菌數(shù)量降低[18];在相同修復(fù)時(shí)間下,亮度減弱快慢順序?yàn)镃K>SMS>SMSB>SIM,這進(jìn)一步說明菌糠中真菌和石油烴降解菌能夠相互促進(jìn)彼此生長,提高細(xì)胞活性.同時(shí)菌糠能夠?yàn)槲⑸锲鸬奖Ｗo(hù)屏障作用,促進(jìn)增殖代謝,提高土壤群落多樣性和豐富度指數(shù).

圖4 土壤DNA V3可變區(qū)的PCR電泳 Fig.4 Soil V3DNA variable region PCR electrophoresis map1:菌糠固定化微生物組;2:菌糠-游離菌組;3:菌糠單獨(dú)組;4:空白對(duì)照; (a)修復(fù)7d;(b)修復(fù)21d;(c)修復(fù)45d

2.2 土壤生理生化參數(shù)及生態(tài)毒性變化

由土壤漆酶和錳過氧化物酶含量變化可見,與其他實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組因分泌漆酶和錳過氧化酶含量較低,基本可忽略不計(jì).

圖5 土壤漆酶活性隨修復(fù)時(shí)間變化 Fig.5 Variation of laccase activities in soil with remediation time

圖6 土壤錳過氧化物酶活性隨時(shí)間變化 Fig.6 Variation of Mn-peroxidase activities in soil with remediation time

菌糠中存在白腐菌等多種真菌,分泌的漆酶和錳過氧化物酶的釋放,有助于土壤石油烴類化合物的去除[19].由圖5~6可以看出,隨著修復(fù)時(shí)間的延長,SIM、SMSB和SMS組中的漆酶活性不斷降低,分別從3.531,3.489,3.459U/g減少至0.726,0.602, 0.542U/g,而錳過氧化物酶活性不斷提高,但在45d時(shí),其活性分別為0.432,0.376,0.325U/g,仍比漆酶活性低,一方面是由于菌糠初始酶含量存在一定的差異[20],另一方面是由于土壤體系較為復(fù)雜,加入菌糠后,土壤抑制了白腐菌等真菌分泌漆酶而促進(jìn)了錳過氧化物酶的分泌.此外,SIM組二者酶活性在整個(gè)修復(fù)過程中均高于其他組,這是由于真菌分泌的多種胞外氧化酶和水解酶[21]與細(xì)菌分泌的胞內(nèi)酶在代謝酶系方面的互補(bǔ)性優(yōu)勢.

圖7 土壤FDA水解酶活性隨時(shí)間變化 Fig.7 Variation of FDA hydrolysis in soil with remediation time

由圖7~8可以看出,土壤中FDA水解酶和脫氫酶與微生物數(shù)量變化趨勢具有一致性.整個(gè)修復(fù)過程中,CK(對(duì)照組),兩種酶活性均在0.3mg/(g·h), 5.0μgTPF/(g·6h)附近波動(dòng),變化不大.而SIM、SMSB、SMS組的酶活性均高于CK組,這是由于外源菌、菌糠的添加以及土壤中石油烴為外源微生物提供新的碳源提高了微生物數(shù)量和代謝活性.此外,兩種酶活性在21d達(dá)到最大,FDA水解酶分別為1.036, 0.979,0.702,0.321mg/(g×h),脫氫酶活性分別為24.76, 22.43,15.57,6.32μgTPF/(g·6h).修復(fù)過程中,SIM組酶活性最高,這是由于菌糠中營養(yǎng)物質(zhì)充足,且固定化方式能夠避免微生物受到外界的毒害作用,進(jìn)而分泌酶能力也相應(yīng)較高[22].35d左右時(shí),石油烴分解的中間產(chǎn)物的毒性累積以及難降解組分的殘留,抑制了微生物的活性,同時(shí)菌糠在土壤中易腐解,結(jié)構(gòu)松散易碎,部分微生物脫落甚至死亡,導(dǎo)致SIM組酶活性略低于SMSB組.然而修復(fù)后期,菌糠腐解產(chǎn)生的腐殖酸作為一種類表面活性劑[23]不僅能夠增加土壤肥力,還能提高微生物對(duì)石油烴的攝取能力,使得SIM組酶活性又高于SMSB組.

圖8 土壤脫氫酶活性隨時(shí)間變化 Fig.8 Variation of dehydrogenase activities in soil with remediation time

2.3 土壤石油烴含量的變化

由9可以看出,隨著修復(fù)時(shí)間延長,石油烴含量逐漸降低,其中在10~28d內(nèi),各組中石油烴降解速率最高,這與上述微生物數(shù)量以及酶活性變化趨勢相一致,45d內(nèi)SIM組中石油烴含量減少29.23mg/g土,降解性能均高于其他組.

生物修復(fù)45d后提取土壤中石油烴進(jìn)行光譜掃描,由圖10可見4組樣品在190~200nm和225~ 240nm處均有吸收,與CK組相比其他3個(gè)處理組樣品吸光度數(shù)值有明顯的減少,說明石油烴分別有不同程度的降解.其中吸光度大小順序?yàn)镃K>SMS> SIMB>SIM.圖11為修復(fù)45d測得的總石油烴降解率[24],分別為63.05(SIM組),51.21(SMSB組),40.90 (SMS組),8.96%(CK組),該結(jié)果與圖10光譜掃描結(jié)果趨勢相一致,菌糠固定化微生物修復(fù)效果最優(yōu).

圖9 不同修復(fù)方式下剩余石油烴含量隨時(shí)間變化 Fig.9 Variation of residual petroleum hydrocarbon content in soil with remediation time under different remediation methods

圖10 不同修復(fù)方式下剩余石油烴光譜掃描圖Fig.10 Spectral scanning diagram of petroleum hydrocarbon under different remediation methods

由圖12可以看出,不同修復(fù)方式下微生物降解石油烴符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型.各組反應(yīng)速率常數(shù)為0.0273,0.0243,0.0137和0.0016/d,實(shí)驗(yàn)組分別是CK組的17.06,15.18,8.56倍,反應(yīng)速率大幅度提高,并明顯縮短生物修復(fù)周期.其中,菌糠固定化微生物組修復(fù)效果最好,這是細(xì)菌-真菌-酶體系共同作用的結(jié)果.細(xì)菌對(duì)簡單烴類的降解速度快,而對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的石油烴降解較為緩慢[25],而真菌能夠分泌多種胞外酶促進(jìn)分子量高、難降解物質(zhì)的分解,減少其對(duì)微生物的毒害作用.此外,利用真菌分泌的P450酶系以及細(xì)菌分泌的胞內(nèi)加氧酶二者代謝酶的互補(bǔ)性優(yōu)勢,達(dá)到高效快速降解土壤中石油烴的目的.

圖11 不同修復(fù)方式下45d后石油烴降解率Fig.11 The degradation rate of petroleum hydrocarbon under different remediation methods after 45d

圖12 不同修復(fù)方式下對(duì)石油烴降解動(dòng)力學(xué)擬合Fig.12 Kinetics of petroleum hydrocarbon degradation under different remediation methods

2.4 石油烴降解主成分分析

利用主成分分析(PCA)深入了解石油烴降解率與修復(fù)過程中環(huán)境因子(微生物數(shù)量、土壤呼吸強(qiáng)度、酶活性等)之間的相關(guān)關(guān)系,為研究修復(fù)機(jī)理論依據(jù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1、2和圖14所示.

PCA各排序軸的特征值和累積解釋量如表1所示,第1、2、3軸的特征值分別為6.558、1.299、0.143,累積值為100%,按照一般提取要求累積解釋量達(dá)85%,并且特征根>1的原則,其中第1、2軸累積值為98.214%(分別為81.972%、16.242%),因此選擇第1、2軸作為主要成分分析,分別記為PC1、PC2.

表1 PCA排序的特征值及累積解釋量 Table 1 Eigen value and cumulative contribution rate

圖13 土壤石油烴降解率與環(huán)境因子的主成分分析 Fig.13 PCA of Petroleum hydrocarbon degradation rate and environmental factors in soils

表2 環(huán)境因子與排序軸之間的相關(guān)性 Table 2 Correlation coefficient of environmental factors with two axes of PCA

注:*在0.05水平的相關(guān)性顯著;**在0.01水平的相關(guān)性顯著.

由圖13可以看出,細(xì)菌、真菌數(shù)量、脫氫酶活性以及土壤呼吸強(qiáng)度位于第1象限,其中細(xì)菌和真菌數(shù)量差異體現(xiàn)在PC2上,而與脫氫酶活性以及土壤呼吸強(qiáng)度差異性體現(xiàn)在PC1上.FDA水解酶和錳過氧化物酶位于第2象限,漆酶位于第3象限,在PC1、PC2均有一定差異性.以上結(jié)果表明不同環(huán)境因子指標(biāo)對(duì)石油烴降解效果影響不相同.由表2可以得到8個(gè)因子與排序軸之間的相關(guān)系數(shù),石油烴降解率與第1軸呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(<0.01),而與第2軸相關(guān)性不明顯.此外,土壤呼吸強(qiáng)度、細(xì)菌、真菌數(shù)量和錳過氧化物酶活性與第1排序軸呈顯著正相關(guān)(<0.05),脫氫酶活性呈顯著正相關(guān)(<0.01),而與漆酶、FDA水解酶活性相關(guān)性不大.

隨著微生物數(shù)量以及土壤呼吸強(qiáng)度的增加,石油烴降解率也相應(yīng)提高,這是由于外源菌的加入包括高效石油烴降解菌和菌糠中的真菌提高了土壤微生物數(shù)量,對(duì)石油烴的去除有顯著的促進(jìn)作用,微生物以石油烴為碳源,不同修復(fù)時(shí)間和方式,對(duì)其利用率也存在差異性,利用程度越高,微生物代謝活動(dòng)增強(qiáng),呼吸強(qiáng)度增加,也相應(yīng)的提高石油烴降解率.脫氫酶為石油烴中氫原子活化提供受氫體[26-27],可實(shí)現(xiàn)石油烴的氧化轉(zhuǎn)化,此外脫氫酶還可反應(yīng)石油烴生物降解活性進(jìn)而用于評(píng)價(jià)降解性能,因此,脫氫酶活性越高表明石油烴降解效果較好,具有顯著正相關(guān)關(guān)系,也進(jìn)一步說明菌糠固定化微生物組修復(fù)效果最佳.

2.5 菌糠固定化微生物強(qiáng)化修復(fù)石油烴污染土壤的作用機(jī)理

土壤修復(fù)過程中雖無需考慮載體的回收問題,但隨著修復(fù)時(shí)間延長,會(huì)成為土壤體系的一部分,因此對(duì)載體材料營養(yǎng)物質(zhì)及無毒無害特性的要求更為嚴(yán)格[28],選擇菌糠作為固定化載體材料,采用吸附法固定石油烴降解菌,制備所得固定化微生物既滿足了營養(yǎng)物質(zhì)的需求,同時(shí)對(duì)土壤也無毒害作用.

與游離菌組相比,固定化微生物組能夠通過表面吸附和微孔填充兩種作用機(jī)制[2]吸附、富集土壤中石油烴,增加微生物對(duì)污染物的生物可利用性.此外,固定化微生物能夠疏松土壤,增強(qiáng)氧氣的流動(dòng),改善土壤環(huán)境,增加土壤肥力,為微生物提供一個(gè)有利的緩沖體系,使得外源降解菌成為優(yōu)勢菌種,同時(shí)該微環(huán)境也是對(duì)土著微生物的一個(gè)重要馴化場所,能提高土著菌的菌密度和活性穩(wěn)定性,進(jìn)而達(dá)到生物刺激與強(qiáng)化協(xié)同作用機(jī)制.綜上所述,菌糠固定化微生物修復(fù)石油污染土壤效果更好,建議采用該方式.

3 結(jié)論

3.1 從土壤菌落結(jié)構(gòu)看,菌糠固定化微生物組在28d左右時(shí)土壤呼吸強(qiáng)度、細(xì)菌及真菌數(shù)量最高分別為41.95mg CO2/(kg×h),7.94′107CFU/g土,22.38′104CFU/g土,能長期使得外源降解菌為優(yōu)勢菌種,維持較高微生物活性.

3.2 修復(fù)45d后,菌糠固定化微生物組對(duì)石油烴的降解效率最高,可達(dá)63.05%,修復(fù)效果最好.比其他多分別高出11.84%,22.15%,54.09%,并能明顯縮短修復(fù)周期.因此,菌糠固定化微生物為最佳土壤修復(fù)方式.

3.3 菌糠固定化微生物對(duì)石油污染土壤修復(fù)具有生物強(qiáng)化和生物刺激協(xié)同作用機(jī)制.載體材料不僅可為外源菌提供生存場所,還可吸附富集石油烴,協(xié)同細(xì)菌-真菌達(dá)到強(qiáng)化修復(fù)的目的.

[1] 齊永強(qiáng),王紅旗,劉敬奇,等.土壤中石油污染物微生物降解過程中各石油烴組分的演變規(guī)律[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2003,23(6):834-836. Qi Y Q, Wang H Q, Liu J Q, et al. Component changes of hydrocarbon during the precess of bioremediation of hydrocarbon- contami natel soil [J]. Acta Scientiae Circumstantiae. 2003,23(6):834- 836.

[2] 錢林波,元妙新,陳寶梁.固定化微生物技術(shù)修復(fù)PAHs污染土壤的研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境科學(xué), 2012,33(5):1767-1776.Qian L B, Yuan M X, Chen B L. Research progress about bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons contaminated soil with immobilized microorganism technique [J]. Environmental Science, 2012,33(5):1767-1776.

[3] Varjani S J, Upasani V N. A new look on factors affecting microbial degradation of petroleum hydrocarbon pollutants [J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2017,120:71-83.

[4] 王麗萍,李 丹,許銳偉,等.專性菌系對(duì)石油烴污染土壤的修復(fù)性能[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2018,38(4):1417-1423.Wang L P, Li D, Xu R W, et al. Remediation performance of constructed specific bacteria on petroleum hydrocarbon contaminated soil [J]. China Environment Science, 2018,38(4):1417-1423.

[5] Mohd Hanafi F H, Rezania S, Mat Taib S, et al. Environmentally sustainable applications of agro-based spent mushroom substrate (SMS): an overview [J]. Journal of Material Cycles and Waste Management, 2018,20(3):1383-1396.

[6] Wu J, Zhang T, Chen C, et al. Spent substrate of Ganodorma lucidum as a new bio-adsorbent for adsorption of three typical dyes [J]. Bioresource Technology, 2018,266:134-138.

[7] 張秀霞,張守娟,張 涵,等.固定化微生物對(duì)石油污染土壤生物學(xué)特性的影響[J]. 石油學(xué)報(bào)(石油加工), 2015,31(1):112-118.Zhang X X, Zhang S J, Zhang H, et al. Influence of immobilized microorganism on biological characteristics of petroleum- contaminated soil [J]. Acta Petrolei Sinica (Petroleum Processing Section), 2015,31(1):112-118.

[8] 王玉建,李紅玉.固定化微生物在廢水處理中的研究及進(jìn)展[J]. 生物技術(shù), 2006,16(1):94-96.Wang Y J, Li H Y. Advances in immobilized microorganism and it’s Research on Waste Water Treatment [J]. Biotechnology, 2006,16(1): 94-96.

[9] Asemoloye M D, Jonathan S G, Jayeola A A, et al. Mediational influence of spent mushroom compost on phytoremediation of black- oil hydrocarbon polluted soil and response of Megathyrsus maximus Jacq [J]. Journal of Environmental Management, 2017,200:253-262.

[10] 寧大亮,王 慧,王立華,等.難降解有機(jī)物對(duì)白腐真菌P450的誘導(dǎo)及P450的作用[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2009,29(4):407-412.Ning D L, Wang H, Wang L H, et al. Induction and function of cytochrome P450 in degradation of refractory organic chemicals by Phanerochaete chrysosporium [J]. China Environment Science, 2009, 29(4):407-412.

[11] 滕 芝.石油污染土壤的微生物強(qiáng)化修復(fù)作用及其機(jī)理研究[D]. 青島:中國石油大學(xué)(華東), 2012.Teng Z. Study on bioaugmentation repair of oil-polluted soil and its mechanism [D]. Qingdao: China University of Petroleum (East China), 2012.

[12] 劉海芳,馬軍輝,金 遼,等.水稻土FDA水解酶活性的測定方法及應(yīng)用[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2009,46(2):365-367.Liu H F, Ma J H, Jin L, et al. Determination of activity of hydrocarbon in paddy soils application in Taihu Lake region [J]. Acta Pedologica Sinica. 2009,46(2):365-367.

[13] Ebadi A, Khoshkholgh Sima N A, Olamaee M, et al. Remediation of saline soils contaminated with crude oil using the halophyte Salicornia persica in conjunction with hydrocarbon-degrading bacteria [J]. Journal of Environmental Management, 2018,219:260-268.

[14] 王聰穎,王 芳,王 濤,等.生物強(qiáng)化和生物刺激對(duì)土壤中PAHs降解的影響[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2010,30(1):121-127.Wang T, Yin C Q, Bian Y R, et al. Effects of bioaugmentation and biostimulation Oil PAHs degradation in soil [J]. China Environment Science. 2010,30(1):121-127.

[15] 賈建麗,李廣賀,張 旭.石油污染土壤生物修復(fù)的中試系統(tǒng)構(gòu)建與運(yùn)行效果[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2005,25(3):339-342. Jia J L, Li G H, Zhang X. Design establishment and operation effect of the pilot system in the oil contaminated soils bioremediation [J]. China Environment Science, 2005,25(3):339-342.

[16] 唐玉姝,魏朝富,顏廷梅,等.土壤質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)研究進(jìn)展[J]. 土壤, 2007,39(2):157-163.Tang Y S, Wei C F, Yan T M, et al. Biological indicator of soil quality: A review [J]. Soils. 2007,39(2):157-163.

[17] 楊 茜,吳蔓莉,聶麥茜,等.石油污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)及微生物生態(tài)效應(yīng)[J]. 環(huán)境科學(xué), 2015,36(5):1856-1863.Yang Q, Wu M L, Nie M Q, et al. Effects and biological response on bioremediation of petroleum contaminated soil [J]. Environmental Science, 2015,36(5):1856-1863.

[18] 姜睿玲,楊統(tǒng)一,唐玉斌,等.多環(huán)芳烴污染對(duì)桑園土壤微生物結(jié)構(gòu)及種群多樣性的影響[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2012,32(9):1655-1661.Jiang R L, Yang T Y, Tang Y B, et al. Effect of PAHs pollution on micmbial stucture and population diversity of mulberry orchard soil [J]. China Environment Science, 2012,32(9):1655-1661.

[19] Li X, Wu Y, Lin X, et al. Dissipation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soil microcosms amended with mushroom cultivation substrate [J]. Soil Biology and Biochemistry, 2012,47:191- 197.

[20] Karanasios E, Tsiropoulos N G, Karpouzas D G, et al. Novel biomixtures based on local Mediterranean lignocellulosic materials: Evaluation for use in biobed systems [J]. Chemosphere, 2010,80(8): 914-921.

[21] 韓慧龍,湯 晶,江 皓,等.真菌-細(xì)菌修復(fù)石油污染土壤的協(xié)同作用機(jī)制研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2008,29(1):189-195.Han H L, Tang J, Jiang H, et al. Synergy between fungi and bacteria in fungi-bacteria augmented remediation of petroleum-contaminated soil [J]. Environment Science, 2008,29(1):189-195.

[22] 肖 敏,高彥征,凌婉婷,等.菲、芘污染土壤中叢枝菌根真菌對(duì)土壤酶活性的影響[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2009,29(6):668-672.Xiao M, Gao Y Z, Ling W T, et al. Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on enzymes activity in soils contaminated by phenanthrene and pyrene [J]. China Environmental Science, 2009,29(6):668-672.

[23] 曾憲成,韓立新,張彩鳳,等.我國腐植酸類表面活性劑應(yīng)用概述[J]. 腐植酸, 2011,(6):1-4.Zeng X C, Han L X, Zhang C F, et al. Outline on development and application of Chinese humic acid surfactants [J]. Humic Acid, 2011,(6):1-4.

[24] Villalobos M, Avila-Forcada A P, Gutierrez-Ruiz M E. An improved gravimetric method to determine total petroleum hydrocarbons in contaminated soils [J]. Water, Air, and Soil Pollution, 2008,194(1-4): 151-161.

[25] Wang S J, Wang X. Bioremediation of petroleum contaminated soils collected all around China: The extensive application and the microbial mechanism [J].Petroleum Science and Technology, 2018, 36(13):974-980.

[26] Du J, Sun P, Feng Z, et al. The biosorption capacity of biochar for 4-bromodiphengl ether: study of its kinetics, mechanism, and use as a carrier for immobilized bacteria [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2016,23(4):3770-3780.

[27] 郭 婷,張承東,張清敏.生物修復(fù)石油污染鹽堿土壤小試模擬系統(tǒng)中土壤性質(zhì)與微生物特性變化[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2010,30(8): 1123-1129.Guo T, Zhang C D, Zhang Q M, et al. Changs of soil properties and microorganism characteristic during bioremediation of petroleum- contaminated saline soil in microscal simulation study [J]. China Environmental Science, 2010,30(8):1123-1129.

[28] 李靜華.固定化微生物強(qiáng)化修復(fù)石油污染土壤的研究[D]. 廣州:華南理工大學(xué), 2017.Li J H. Bioaugmentation of crude-oil contaminated soil by immobilized microorganisms [D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2017.

致謝：本實(shí)驗(yàn)在張亮同學(xué)的指導(dǎo)下完成,并協(xié)助采樣工作,在此表示感謝.

Bioremediation of petroleum contaminated soil by microoganisms enhanced with spent mushroom substrate.

ZHANG Bo-fan1, XIONG Xin1, HAN Zhuo2, ZHANG Xiu-xia1*, LIU Ze-yang1, MA Nian1, LIU Hui-e1, GU Ying-ying1

(1.College of Chemical Engineering, China University of Petroleum(East China), Qingdao 266580, China；2.Technical Detection Center of Shengli Oilfield Branch, Dongying 257000, China)., 2019,39(3)：1139~1146

The spent mushroom substrate (SS) and.sp.Q2 bacteria were used to remediate petroleum-contaminated soil and four different treatments which contained spent mushroom substrate immobilized microorganisms (SIM), spent mushroom substrate-free bacteria (SMSB), spent mushroom substrate alone (SMS) and no treatment (CK) were designed in this paper. The aim of this study is to investigate soil microbial number, enzyme activities and the degradation rate of total petroleum hydrocarbon (TPH), exploring an ideal reparative treatment. The results indicated that soil respiration intensity, microbial number and enzyme activities of SIM group were obviously higher than others and the removal rate of TPH was highest which wasincreased by 11.84%, 22.15% and 54.09% compared with other treatments. Furthermore it is showed that the dehydrogenase activity and microbial activity were significantly correlated with the degradation rate of TPH and immobilized microorganism had the synergistic mechanism of bioaugmentation and biostimulation for remediation of petroleum contaminated soil.

spent mushroom substrate；immobilized microorganism；remediation of soil；degradation rate of oil

X53

A

1000-6923(2019)03-1139-08

張博凡(1994-),女,河北石家莊人,中國石油大學(xué)(華東)碩士研究生,主要研究方向?yàn)榄h(huán)境污染控制技術(shù).

2018-07-31

中國石油科技創(chuàng)新基金研究項(xiàng)目(2017D-5007-0601);山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2014BM023)

* 責(zé)任作者, 教授, zhxiuxia@upc.edu.cn