雞巨型艾美耳球蟲早熟株選育及其生物學特性研究

郝飛飛，王天成，張 黎，彌成龍，馮玉萍，張雪松，鄭明學

(山西農業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801)

雞球蟲病是由于艾美耳球蟲寄生于雞腸道內所引起的一種危害極嚴重的全球性寄生蟲病[1-2]，我國將其列為二類動物疫病。雞感染球蟲后一般表現(xiàn)為慢性經(jīng)過，發(fā)病期間飼料轉化率降低且雞生長緩慢，給肉雞體質量的增加造成了嚴重威脅；但若表現(xiàn)為急性感染，雞的死亡率則高達80%[3]。目前，給我國傳統(tǒng)養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重危害的球蟲包括雞柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)、毒害艾美耳球蟲(E.nectrix)、堆形艾美耳球蟲(E.acervulina)和巨型艾美耳球蟲(E.maxima)。其中，雞E.maxima病流行性廣，且對雞的生長和體質量的增加影響嚴重，感染后雞的相對體質量增加率可下降50%以上[4]。我國是養(yǎng)雞大國，每年用于抗球蟲藥物的花費約為雞病全部防治費用的30%，且這一數(shù)據(jù)還在持續(xù)上升[5]。

將球蟲活苗制備成疫苗對雛雞進行免疫，是實際生產中唯一可替代抗球蟲藥物來控制球蟲病的方法[6-7]。目前，商用的雞球蟲疫苗有強毒活疫苗和弱毒活疫苗。由球蟲親本株制備的強毒活疫苗雖然免疫效果良好，但使用不當易導致免疫失敗，甚至導致雞場暴發(fā)球蟲病；而由球蟲親本株選育出的早熟株是全世界公認的免疫原性好、致病力低且遺傳穩(wěn)定的球蟲疫苗蟲株[8]，由其制備的弱毒活疫苗在世界范圍內被廣泛使用。山西農業(yè)大學獸醫(yī)病理實驗室前期已從雞E.acervulina、E.nectrix、E.tenella的親本株中成功選育出其各自的早熟株，球蟲多價弱毒苗的制備還缺少E.maxima早熟株。在疫苗中添加E.maxima早熟株能夠增加其免疫原性，同時配合基因佐劑加強免疫能夠縮短免疫空窗期，降低疫苗副作用，從而對雞球蟲病起到更好的預防效果。因此，本研究選用由山東分離出的雞E.maxima進行早熟株選育，旨在為球蟲多價苗提供E.maxima早熟株蟲種并研究其生物學特性，為防治球蟲病提供相關依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 雞E.maxima親本株與供試動物

供試雞E.maxima親本株為山東分離株(潛隱期124 h)，由山西農業(yè)大學獸醫(yī)病理實驗室保存與提供。無特定病原(SPF)雛雞由北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞E.maxima早熟株的選育 14日齡SPF雛雞(20羽/批)以1.0×104個/羽的劑量口服接種E.maxima親本株孢子化卵囊，接種后123 h起每小時檢查1次雞糞便中有無球蟲卵囊。記錄每次接種后最先發(fā)現(xiàn)卵囊的時間。由此開始，連續(xù)收集10 h雞糞便中的卵囊，在體外培養(yǎng)成熟后繼續(xù)接種下一批雛雞。連續(xù)傳代至蟲株潛隱期時，則表明成功選育出雞E.maxima早熟株。

1.2.2 雞E.maxima早熟株和親本株潛隱期的卵囊形態(tài)觀察 于14日齡時對空腹的SPF雛雞進行體質量稱量，將42羽體質量接近的雛雞隨機分為2個組，每組21羽，分別以20.0×104個/羽的劑量口服接種E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊。接種后以24 h為間隔，在2個組中分別隨機挑取3羽雞進行剖檢。觀察雞空腸有無肉眼可見的病變，并取空腸中段卵黃蒂附近的腸上皮進行組織涂片，同時對該部位腸道進行取材并制作石蠟切片，經(jīng)HE染色后于光鏡下觀察裂殖體及卵囊出現(xiàn)時間，以及球蟲卵囊孢子化前的大小。

1.2.3 雞E.maxima早熟株致病性和繁殖力的比較 于14日齡時對空腹的SPF雛雞進行體質量稱量，將110羽體質量接近的雛雞隨機分為11組，每組10羽，其中，5組為親本株接種組，5組為早熟株接種組，分別按照0.1×104、0.5×104、1.0×104、10.0×104、20.0×104個/羽的劑量梯度口服接種E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊，剩余1組為空白對照組，每羽雞口服等量不含蟲株的稀釋液。

接種后每天觀察雞的精神狀況、糞便的質地和顏色以及發(fā)病死亡情況。收集接種后5～7 d雞糞便中的卵囊，通過計算排卵囊總量和單卵囊繁殖力來比較雞E.maxima親本株和早熟株的繁殖力。其中，排卵囊總量為排卵囊期間每羽雞平均卵囊總產量。單卵囊繁殖力為每羽雞排卵囊總量與接種劑量的比值。

于接種后168 h，將雞逐一空腹稱體質量后進行剖解，記錄死亡數(shù)、體質量、病變記分。通過死亡率、相對體質量增加率并結合腸道病變記分對雞E.maxima早熟株和親本株的致病性進行比較分析。其中，死亡率為各組死亡雞的數(shù)量與組內雞總數(shù)的百分比。相對體質量增加率=感染組雞平均增質量/空白組雞平均增質量×100%。病變記分依據(jù)JOHNSON等[9]的方法對雞小腸中段進行病變記分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Prism 6.0整理數(shù)據(jù)并繪制圖表，采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和t檢驗。

2 結果與分析

2.1 雞E.maxima早熟株的選育

14日齡雛雞口服接種E.maxima親本株孢子化卵囊1.0×104個/羽來進行早熟株的選育，結果顯示，每次傳代后其潛隱期可縮短1～2 h，在第13代時成功選育出潛隱期為113 h的E.maxima早熟株。繼續(xù)將選育出的E.maxima早熟株在雛雞體內進行連續(xù)擴繁時發(fā)現(xiàn)，潛隱期能夠穩(wěn)定在113 h，且選育出的E.maxima早熟株繁殖力和致病性穩(wěn)定，能夠穩(wěn)定傳代，表明成功選育出E.maxima早熟株。

2.2 雞E.maxima早熟株和親本株潛隱期的卵囊形態(tài)

自雛雞接種E.maxima早熟株后每隔24 h隨機剖解3羽，觀察空腸中段腸黏膜中裂殖體、卵囊的數(shù)量及大小。結果發(fā)現(xiàn)，其第1代、第2代裂殖體數(shù)量與親本株接近，但是第3代裂殖體數(shù)量較親本株明顯減少；E.maxima早熟株接種后113 h，空腸腸道黏膜上皮中可見卵囊，形狀呈卵圓形，囊壁分2層，少數(shù)因附著顆粒狀物顯粗糙(圖1)，而親本株在124 h時方可見卵囊；且早熟株卵囊長、寬平均為29.18 μm和21.74 μm，顯著小于親本株卵囊30.23 μm和22.13 μm(表1)。表明早熟株的發(fā)育與親本株相比存在缺陷。

圖1 接種E.maxima早熟株113 h后雞空腸黏膜中的E.maxima卵囊(400×)Fig.1 E.maxima oocysts in the jejunal mucosa of chicks after inoculation of E.maxima precocious strains 113 h(400×)

μm

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:The different lowercase letters after data in the same column mean significant difference atP<0.05.

2.3 雞E.maxima親本株和早熟株的致病性分析

接種E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊的雞在接種后7 d內均無死亡現(xiàn)象；臨床癥狀表現(xiàn)為精神不振、食欲下降、低頭縮頸；隨著E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊接種劑量的增加，雞的糞便變稀，內容物呈橘黃色。由圖2和圖3可知，E.maxima親本株和早熟株接種雞的相對體質量增加率均隨接種劑量的增加逐漸降低，而病變記分逐漸升高；當雞E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊接種劑量為0.5×104～20.0×104個/羽時，早熟株組雞的相對體質量增加率顯著大于親本株組；當雞E.maxima親本株孢子化卵囊的接種劑量在10.0×104～20.0×104個/羽時,親本株組雞的相對體質量增加率無顯著性差異；接種劑量在10.0×104～20.0×104個/羽時，早熟株組雞的腸道病變記分顯著低于親本株組。表明隨接種劑量的增加，E.maxima親本株和早熟株對雛雞體質量增加影響逐漸嚴重；且在相同接種劑量下，親本株的致病力強于早熟株。

2.4 雞E.maxima親本株和早熟株的繁殖力分析

當雞E.maxima親本株和早熟株的接種劑量為0.1×104～20.0×104個/羽時，相同接種劑量下早熟株組的雞E.maxima卵囊產量均顯著低于親本株組，早熟株組雞的E.maxima卵囊產量是親本株組的60%～75%，表明在同等接種劑量下，早熟株卵囊繁殖力低于其親本株，且雞E.maxima親本株和早熟株的卵囊產量均隨接種劑量增加而增高(圖4)，但單卵囊繁殖力反而逐漸降低(圖5)。

*表示處理間差異顯著(P<0.05)，圖3和圖4同*means significant differences (P<0.05).The same as Fig.3 and Fig.4圖2 雞E.maxima親本株和早熟株不同接種劑量對雛雞體質量的影響Fig.2 Effect of different inoculation dose of E.maximavirulent and precocious strains on the weight gain of chicks

圖3 雞E.maxima親本株和早熟株不同接種劑量對雛雞腸道的影響Fig.3 Effect of different inoculation dose of E.maximavirulent and precocious strains on the intestinal tract of chicks

圖4 雞E.maxima親本株和早熟株不同接種劑量對卵囊產量的影響

圖5 雞E.maxima親本株和早熟株不同接種劑量對E.maxima單卵囊繁殖力的影響

3 結論與討論

雞E.maxima親本株裂殖生殖階段發(fā)育完整，但由于早熟株最后1代裂殖體發(fā)育有缺陷，會導致卵囊形成并排出的時間較親本株縮短。因此，早熟選育法利用雞E.maxima親本株和早熟株排卵時間有差異的特點，通過親代蟲株多次選擇最早成熟的卵囊反復傳代，篩選出在生物學特性方面與親本株有差異的早熟株[10]。本研究中，雞E.maxima親本株的潛隱期為124 h，在經(jīng)過13代選育之后，早熟株的潛隱期與排卵高峰都提前11 h左右,早熟株的第1代、第2代裂殖體數(shù)量與親本株相近，而第3代裂殖體數(shù)量明顯減少,且早熟株卵囊顯著小于親本株，與蔣金書[11]關于球蟲早熟株特性的報道一致。

目前，已證實E.maxima的主要毒力來源于其裂殖生殖和配子生殖階段。由于E.maxima的裂殖體寄生在腸道絨毛較深的部位，且相對于其他球蟲來說體積較大，因此，在這個階段的E.maxima容易造成腸道上皮細胞的死亡，進而使腸道上皮發(fā)生脫落崩解引起繼發(fā)性腸炎。本研究中，各試驗組雞均無死亡且無異常表現(xiàn)，在雞E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊接種劑量為0.5×104～20.0×104個/羽時，同等劑量下親本株組雞的相對體質量增加率均顯著低于早熟株組，且病變記分高于早熟株組。早熟株組雞小腸內出現(xiàn)脹氣，漿膜發(fā)紅充血，腸內容物少，各組病變記分均≤0.7；而親本株組雞的空腸可見少量出血點，內容物呈黃褐色，各組病變記分均≤1.0。說明雞E.maxima親本株對雞腸道的致病作用強于早熟株。而E.maxima早熟株最后一代裂殖體發(fā)育不完全，形成的后代卵囊數(shù)量少，因而較其親本株對雞腸道造成的損傷更低，使其致病力減弱[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在相同接種劑量下，雞E.maxima早熟株組卵囊產量均低于親本株組。劉麗丹[13]報道，在相同接種劑量下布氏艾美耳球蟲的繁殖能力顯著高于其選育的早熟株，與本研究結果相同。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，雞E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊接種劑量在20.0×104個/羽和10.0×104個/羽時，其卵囊產量并無顯著性差異，而且單卵囊繁殖力隨接種劑量的增高也逐漸降低，符合研究者提出的“擁擠效應”[14]。當接種量較低時，可供配子體寄生的腸黏膜上皮細胞數(shù)量多，充足的空間與營養(yǎng)給與球蟲良好的生存條件，經(jīng)過有性生殖后生成的卵囊數(shù)量多且隨糞便排出體外，但是當接種劑量較大時，腸道內充滿被釋放的裂殖子，反而因為沒有足夠的腸上皮細胞供其寄生而導致死亡并排出體外，達到“過飽和”狀態(tài)[15]。在本研究進行致病性觀察時也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，即雞E.maxima親本株孢子化卵囊接種劑量在10.0×104個/羽和20.0×104個/羽時雞的相對體質量增加率無顯著性差異，表明當雞E.maxima親本株孢子化卵囊接種劑量在1.0×104～10.0×104個/羽時，雞的腸上皮細胞已達到感染數(shù)量閾值，早熟株組結果與之類似。

試驗中對雞E.maxima親本株和早熟株的生物學特性進行比較發(fā)現(xiàn)，與親本株相比，早熟株對雞腸道的損傷程度降低、繁殖能力下降。本研究前期試驗中，趙雁萍[16]也已經(jīng)對雞E.maxima山西株繁殖力作過相關研究，觀察到隨接種劑量的增加卵囊產量也隨之增大。本研究中也證實，雞E.maxima早熟株對雞的腸道損傷和增質量影響沒有親本株嚴重，且早熟株在低劑量接種時對雞腸道的損失甚微。但是雞E.maxima早熟株是否保持其親本株完整的免疫原性，能否作為疫苗進行球蟲病免疫，劑量該如何選擇還有待深入探究。