苦參堿對白血病細胞K562誘導凋亡作用的研究

薛鈺婷 冷波（通訊作者）

（1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科 四川 瀘州 646000）

（2西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院普外科 四川 瀘州 646000）

急性髓細胞白血病(AML)是造血干細胞惡性克隆性疾病。使白血病細胞凋亡，是治療白血病的重要治療方法?？鄥A(Matrine，MA)是傳統(tǒng)中藥苦參(Sophora flavescens Ait)的主要成分。研究顯示[1]阿霉素使用在誘導MCF-7細胞凋亡中加入苦參堿可增加其誘導作用。研究報道[2]順鉑類藥物在聯(lián)合苦參堿藥物使用時，可增強誘導SH-SY5Y的凋亡的作用，從而提高化療的敏感性[3]。

本研究采用苦參堿藥物作為影響因子，白血病細胞K562為研究對象，探索不同濃度苦參堿（0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml）作用于K562細胞，檢測凋亡相關因子caspase-3活性，探索隨苦參堿藥物濃度的增加，對白血病K562誘導凋亡的作用，并應用統(tǒng)計學分析差異。為苦參堿今后應用于白血病化療提供實驗依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 人白血病細胞株K562

1.1.2 主要實驗試劑 苦參堿(純度＞0.98，相對分子質量248.36)，胎牛血清，RPMI1640培養(yǎng)基，caspase-3檢測試劑盒等。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物配制 苦參堿呈粉末狀，需配制濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml使其終濃度為0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml備用。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將凍存冰箱的K562細胞取出，置于37℃水浴箱溶解，離心1000r/5min，去除上清液，用已經(jīng)配制好的培養(yǎng)基培養(yǎng)。復蘇后的細胞用培養(yǎng)瓶裝載，置于5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天換液傳代。

1.2.3 實驗分組 用苦參堿以下的濃度（0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml）作用于K562為實驗組，空白組只需加培養(yǎng)基作為對照，陰性組加0.01%DMSO為對照。

1.3 檢測指標及方法

凋亡相關因子caspase-3活性的檢測

操作步驟：

1.3.1 取對數(shù)生長期細胞，將細胞濃度調整為2×106/ml加入六孔板，設計六個實驗組，空白組設置一個，其余五個為實驗組，每組重復四孔。在六孔板里的每個孔加細胞懸液2ml，第一孔加2ml培養(yǎng)基為陰性組，其余四孔分別加入苦參堿，其終濃度分別是0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml各2ml為實驗組。

1.3.2 置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。

1.3.3 收集對照樣品（即沒有誘導凋亡的）和樣品組（即誘導凋亡的），離心1000r/5min，去掉清液，PBS洗滌一次。

1.3.4 同前吸盡上清，按每200萬細胞加入100微升裂解液的比例加入，重懸沉淀，冰浴裂解15分鐘。

1.3.5 離心3000r/10min，把上請轉移到96孔板。

1.3.6 caspase-3活性檢測：按試劑盒說明操作。

1.4 統(tǒng)計學處理

運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理。計量資料用均值±標準差（±s）表示，各組應用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

實驗結果：不同濃度的苦參堿0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml作用于白血病K562均能升高caspase-3活性，caspase-3活性呈升高趨勢其受苦參堿濃度增加的影響，呈劑量依賴性。實驗組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同濃度組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表。

表 不同濃度苦參堿作用K562升高caspase-3活性的作用（72h）

3.討論

急性髓細胞白血病是多能干細胞或已輕度分化的前體細胞核型發(fā)生突變所形成的克隆性惡性疾病。利用我國傳統(tǒng)中醫(yī)優(yōu)勢，從中藥中尋找經(jīng)濟、有效、毒副作用小的抗白血病藥物，在醫(yī)學研究具有前景。如研究證實[4-5]植物多糖通過阻止凋亡蛋白激活信號通路，誘導白血病細胞K562分化，使用苦參堿后從而抑制腫瘤細胞生長[6]。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，caspase的全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，能夠導致程序性細胞死亡。caspase-3活性檢測試劑盒（caspase-3 Aspartate Protease）是采用分光光度法檢測細胞或組織裂解液中的caspase-3酶活性的試劑盒。本試劑盒基于caspase-3可以催化底物Ac-DEVD-pNA而產(chǎn)生黃色的pNA，通過測定吸光度來檢測caspase-3活性。

本研究內容為使用不同濃度的苦參堿藥物為影響因子，作用于白血病K562細胞，按說明書的操作方法檢測caspase-3，結果可見：苦參堿均能激活caspase-3（不同的濃度），其作用活性隨著苦參堿的濃度增加而呈現(xiàn)增強趨勢，并用統(tǒng)計學分析處理后顯示結果具有統(tǒng)計學意義。

綜上所述，苦參堿作用于白血病K562細胞能夠升高caspase-3活性，通過激活caspase-3途徑誘導細胞凋亡。從探索中發(fā)現(xiàn)，苦參堿藥物有希望成為臨床上輔助治療白血病的一種有效、安全、實用的新藥物。