正極性駐極體5-氟尿嘧啶貼劑對兔耳瘢痕組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TCF-β表達(dá)的影響

安曉強(qiáng)，苑 旺,梁媛媛,郭 鑫，梁合鵑,江 鍵，崔黎麗

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院無機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)勤系數(shù)理教研室，上海 200433)

瘢痕常發(fā)生在外科手術(shù)、外傷及燒傷后，是人體組織創(chuàng)傷修復(fù)過程中的必然產(chǎn)物。瘢痕不僅影響患者的外觀，還可以引起嚴(yán)重的功能障礙甚至致殘，為患者后期治療帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，成為當(dāng)前康復(fù)醫(yī)學(xué)、整形學(xué)、燒傷和創(chuàng)傷等領(lǐng)域亟待解決的醫(yī)學(xué)難題之一[1]。

研究表明：增生性瘢痕的形成與炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的過度增殖、細(xì)胞因子和生長因子的異常表達(dá)、以及Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的過度沉積等因素密切相關(guān)[2-4]。

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)可通過抑制創(chuàng)面炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等生長因子的表達(dá)、阻斷參與膠原合成的信號通道，實(shí)現(xiàn)對增生性瘢痕的有效治療[5-7]。

駐極體是一種具有長期儲存極化和空間電荷能力的功能電介質(zhì)材料，與藥物聯(lián)合作用于體表，其產(chǎn)生的外靜電場可促使藥物以恒定(或接近恒定)的速度進(jìn)入皮膚，從而產(chǎn)生局部或全身治療作用。研究結(jié)果表明：駐極體對5-FU、利多卡因、美洛昔康、環(huán)孢菌素A、胰島素等均具有良好的緩控釋給藥作用[8-11]。

本研究將+5 kV駐極體、5-FU貼劑和+5 kV駐極體5-FU貼劑分別作用于兔耳創(chuàng)面后，通過瘢痕增生指數(shù)測算、蘇木精-伊紅(HE)染色和馬松(Masson)染色，比較研究上述駐極體、5-FU貼劑和駐極體5-FU貼劑對兔耳瘢痕生長的影響，利用免疫組織化學(xué)方法對增生性瘢痕組織中的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β含量進(jìn)行檢測，探究正極性駐極體5-FU貼劑抑制增生性瘢痕生長的機(jī)制，以期為臨床增生性瘢痕的治療提供新思路、新方法和新手段。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

聚丙烯(polypropylene，PP)薄膜(日本東麗株式會社，厚度為13 μm)；5-FU(上海生物工程有限公司)；丙烯酸樹脂(EudragitE100，德國Rohm公司)；水溶性氮酮(貝麗萊斯生物化學(xué)有限公司)；檸檬酸丁三酯、無水乙醇、二甲苯、烏拉坦等(中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸(pH6.0)抗原修復(fù)液、牛血清白蛋白(BSA，Servicebio公司)；一抗分別為兔抗Ⅰ型膠原抗體(Rabbit Anti-Collagen Ⅰ antibody，博奧森)、兔抗Ⅲ型膠原抗體(Rabbit Anti-Collagen Ⅲ antibody，博奧森)、抗TCF-β1抗體(Abcam公司)；二抗為HRP-山羊抗兔鼠(通用、DAKO公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(DAKO公司)。實(shí)驗動物為普通級新西蘭大白兔[體質(zhì)量為(2～2.5) kg]，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗動物中心[動物合格證號：SCXK(滬)2018-0001]。

1.2 儀器

柵控恒壓電暈充電系統(tǒng)(大連理工大學(xué)靜電與特種電源研究所)，表面電位計(ESR102A型振動電容靜電計，北京華晶匯科技有限公司)，F(xiàn)A2004B電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1駐極體的制備

通過柵控恒壓電暈充電系統(tǒng)對雙裸面PP膜進(jìn)行充電，制備成表面電位為+5 kV的駐極體。電暈電壓為15 kV，柵壓為5 kV，充電時間為5 min。駐極體等效表面電位通過表面電位計測量。

1.3.2貼劑的制備

根據(jù)徐立麗碩士學(xué)位論文中報道的方法[12]，制備貼劑如下：取0.25 g Eudragit E100和0.138 g檸檬酸丁三酯于1.2 ml無水乙醇中，超聲溶解20 min，加入10 mg 5-FU固體粉末和一定量的3%氮酮，超聲溶解呈透明溶液。冷卻后涂布在4 cm×4 cm聚丙烯膜(背襯層)上。常溫下自然揮干12 h，覆蓋防粘層，制備得到單張5-FU貼劑。將5-FU貼劑的背襯層與+5 kV駐極體充電面復(fù)合，得到駐極體5-FU貼劑。

1.3.3兔耳瘢痕模型的建立

兔齡3～4月的健康新西蘭白兔，20%烏拉坦(1 g/kg)耳緣靜脈注射麻醉，打孔器制造直徑1.0 cm的圓形創(chuàng)面，手術(shù)刀完整切除全層皮膚，剝除軟骨膜，保留耳軟骨。

兔耳創(chuàng)面形成2周后，分別貼敷+5 kV駐極體、5-FU貼劑、+5 kV駐極體5-FU貼劑，分別取各組術(shù)后4周瘢痕組織用于瘢痕增生指數(shù)測算、組織顯微結(jié)構(gòu)的觀察和Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及TGF-β含量的測定。

1.4 瘢痕增生指數(shù)

瘢痕增生指數(shù)=瘢痕中部最高點(diǎn)至軟骨表面的距離/周圍正常皮膚至軟骨表面距離

1.5 瘢痕組織的顯微觀察

將自然愈合4周的瘢痕組織，以及經(jīng)+5 kV駐極體、5-FU貼劑、+5 kV駐極體5-FU貼劑作用4周的瘢痕組織分別置于4%多聚甲醛中固定48 h后，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋，切片備用。

將上述切片經(jīng)脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色和脫水封片等處理制備成HE染色切片，切片在顯微鏡下觀察瘢痕組織的顯微結(jié)構(gòu)。

將上述切片經(jīng)脫蠟、蘇木素染色、麗春紅染色、磷鉬酸處理、苯胺藍(lán)染色和脫水封片等處理制備成Masson染色切片，切片在顯微鏡下觀察瘢痕組織的膠原分布。

1.6 免疫組化

石蠟切片脫蠟、水化，組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，磷酸緩沖液(PBS)沖洗，切片放入3%過氧化氫溶液[雙氧水-純水為(1∶9)]，室溫避光孵育25 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，組化圈內(nèi)滴加3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min進(jìn)行血清封閉，傾去后滴加一抗(CollagenⅠ、Ⅲ和TGF-β抗體濃度均為1∶100)，4 ℃孵育過夜，次日PBS沖洗，滴加二抗，室溫孵育50 min，PBS沖洗，再經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染返藍(lán)，脫水、透明，中性樹膠封片，鏡下觀察，并用跨平臺(IPP)軟件分析。

1.7 圖像分析

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗，以P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕增生指數(shù)

圖1給出了各組皮膚組織的瘢痕增生指數(shù)，結(jié)果顯示：①跟自然愈合組相比，+5 kV駐極體貼劑作用后瘢痕增生指數(shù)稍有降低，說明+5 kV駐極體貼劑組瘢痕增生程度有所改善。②5-FU貼劑作用后，瘢痕增生指數(shù)明顯降低，說明該組瘢痕增生程度較前兩組有明顯下降。③+5 kV駐極體5-FU貼劑作用后，與5-FU組相比，瘢痕增生指數(shù)有所減小，說明該組瘢痕增生程度進(jìn)一步降低。④各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各類皮膚組織的瘢痕增生指數(shù) 1.自然愈合(瘢痕)皮膚；2.+5kV駐極體貼劑作用后瘢痕皮膚；3.5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚；4.+5 kV駐極體5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚

2.2 HE染色

圖2給出了正常皮膚、瘢痕組織(術(shù)后4周后)以及經(jīng)+5 kV駐極體、5-FU貼劑和+5 kV駐極體5-FU貼劑作用4周時間后創(chuàng)面皮膚的HE染色照片。圖2結(jié)果顯示：①自然愈合組的表皮和真皮比正常組織增生明顯，表皮細(xì)胞層數(shù)增多，膠原纖維粗大、分布密集、排列無序，可見漩渦狀結(jié)構(gòu)和膠原結(jié)節(jié)，且成纖維細(xì)胞密集分布于膠原纖維周圍，呈現(xiàn)出典型的增生性瘢痕的組織結(jié)構(gòu)。②與自然愈合(瘢痕)皮膚組織相比，+5 kV駐極體作用后，真皮層成纖維細(xì)胞密度稍有下降，膠原纖維沉積稍有緩解，但無顯著性差異，說明+5 kV駐極體未促進(jìn)增生性瘢痕的生長。③5-FU貼劑作用后，膠原纖維沉積狀況明顯改善，成纖維細(xì)胞密度明顯下降，說明5-FU貼劑對增生性瘢痕的生長具有抑制作用。④+5 kV駐極體5-FU貼劑作用后，成纖維細(xì)胞密度進(jìn)一步下降，膠原纖維沉積進(jìn)一步緩解，說明+5 kV駐極體5-FU貼劑進(jìn)一步抑制了增生性瘢痕的生長。

2.3 Masson染色

為了進(jìn)一步研究正極性駐極體5-FU貼劑對瘢痕形成過程中膠原合成的影響，我們采用Masson染色技術(shù)研究了瘢痕皮膚，經(jīng)+5 kV駐極體、5-FU貼劑和+5 kV駐極體5-FU貼劑作用4周后瘢痕皮膚中膠原合成及其結(jié)構(gòu)的變化(圖3)。結(jié)果顯示：①瘢痕皮膚中膠原纖維(藍(lán)色部分)結(jié)構(gòu)致密，纖維束粗大，排列紊亂，呈現(xiàn)出增生性瘢痕典型的膠原排列特點(diǎn)。②與瘢痕組織相比，經(jīng)+5 kV駐極體作用4周的瘢痕皮膚膠原纖維密度及排列稍有改善，但無顯著性差異。③5-FU貼劑作用后，膠原纖維束排列有序，間隙變寬，膠原密度下降，說明5-FU抑制了瘢痕組織中膠原的合成和沉積。④與5-FU貼劑組相比，+5 kV駐極體5-FU貼劑作用兔耳皮膚4周，瘢痕皮膚組織的膠原排列進(jìn)一步有序，膠原密度進(jìn)一步下降。+5 kV駐極體5-FU貼劑抑制增生性瘢痕形成的能力更強(qiáng)。

2.4 免疫組化

免疫組化顯示，蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，膠原和TGF-β陽性表達(dá)為棕黃色。圖4、圖5和圖6分別給出了術(shù)后4周后各組皮膚組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原和TGF-β的變化情況。結(jié)果顯示：①正常皮膚組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β呈低表達(dá)。②自然愈合組與+5 kV駐極體組膠原和TGF-β呈強(qiáng)陽性表達(dá)，Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β表達(dá)量較正常皮膚均有顯著增加，但+5kV駐極體組表達(dá)水平稍低。③5-FU貼劑作用后，膠原和TGF-β表達(dá)較自然愈合組顯著降低。④+5 kV駐極體5-FU貼劑進(jìn)一步降低了瘢痕組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的沉積和TGF-β表達(dá)量。說明正極性駐極體5-氟尿嘧啶貼劑通過調(diào)控瘢痕組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑制增生性瘢痕生長的目的。圖7給出了各組Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β的平均光密度值，可見Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β的含量在各組中的分部規(guī)律相同，其中自然愈合組與+5 kV駐極體組中三者含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余各組中三者含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各類皮膚組織的HE染色圖(×200) A.正常皮膚；B.自然愈合(瘢痕)皮膚；C.+5 kV駐極體貼劑作用后瘢痕皮膚；D.5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚；E.+5 kV駐極體5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚

圖3 各類皮膚組織的Masson染色圖(×200) A.正常皮膚；B.自然愈合(瘢痕)皮膚；C.+5 kV駐極體貼劑作用后瘢痕皮膚；D.5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚；E.+5 kV駐極體5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚

圖4 各類皮膚組織Ⅰ型膠原免疫組化染色照片(×200) A.正常皮膚；B.自然愈合(瘢痕)皮；C.+5 kV駐極體貼劑作用后瘢痕皮膚；D.5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚；E.+5 kV駐極體5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚

圖5各類皮膚組織Ⅲ型膠原免疫組化染色照片(×200) A.正常皮膚；B.自然愈合(瘢痕)皮膚；C.+5 kV駐極體貼劑作用后瘢痕皮膚；D.5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚；E.+5 kV駐極體5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚)

圖6 各類皮膚組織TCF-β免疫組化染色照片(×200) A.正常皮膚；B.自然愈合(瘢痕)皮膚；C.+5 kV駐極體貼劑作用后瘢痕皮膚；D.5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚；E.+5 kV駐極體5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚

圖7 各類皮膚組織Ⅰ、Ⅲ型膠原和TCF-β平均光密度值 A.Ⅰ型膠原；B.Ⅲ型膠原；C.TCF-β；1.正常皮膚；2.自然愈合(瘢痕)皮膚；3.+5 kV駐極體貼劑作用后瘢痕皮膚；4.5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚；5.+5 kV駐極體5-FU貼劑作用后瘢痕皮膚

3 討論

增生性瘢痕是臨床多發(fā)病和常見病,其形成與炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的過度增殖、細(xì)胞因子和生長因子的異常表達(dá)、以及Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的過度沉積等因素密切相關(guān)。本實(shí)驗中，兔耳創(chuàng)面自然愈合4周后，新生皮膚組織真皮增生明顯，膠原纖維粗大、排列無序、分布密集，成纖維細(xì)胞密集分布于膠原纖維周圍，Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β的表達(dá)量顯著升高，表現(xiàn)出增生性瘢痕皮膚典型的生物學(xué)特征。為此，本實(shí)驗成功構(gòu)建了兔耳增生性瘢痕模型。

5-FU是胸苷酸合成酶抑制劑和抗嘧啶類藥物，在諸多文獻(xiàn)中被報道對增生性瘢痕有確切的療效[13-16]。本研究中，經(jīng)5-FU作用后，創(chuàng)面組織顯微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出膠原纖維束排列有序，間隙變寬，密度下降的現(xiàn)象，且創(chuàng)面組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β的含量顯著降低，說明5-FU對增生性瘢痕的生長具有一定的抑制作用。

以往研究表明，駐極體產(chǎn)生的外靜電場可調(diào)控皮膚角質(zhì)層的顯微結(jié)構(gòu)[17-20]，降低藥物經(jīng)皮滲透時的物理阻抗，有利于藥物透過角質(zhì)層進(jìn)入皮膚深層組織，同時正極性駐極體產(chǎn)生的外靜電場對負(fù)極性藥物的靜電吸引力使大量5-FU滯留在皮膚深層組織，增加了藥物在皮膚組織內(nèi)的滯留量，與5-FU聯(lián)用對瘢痕起到更好的治療作用。前期研究中，課題組曾設(shè)計了+500 V、+1 kV、+2 kV等一系列不同表面電位的駐極體進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)正極性駐極體5-FU貼劑抑制增生性瘢痕生長的療效與駐極體的等效表面電位大小成正比，隨著駐極體表面電位的增加，貼劑中藥物的累積釋藥量和皮膚中藥物含量都有所增加，因此，本研究中選用表面電位較高的+5 kV駐極體聯(lián)用5-FU作用于兔耳瘢痕。經(jīng)正極性駐極體貼劑作用后，與自然愈合(瘢痕)皮膚組織相比，真皮層成纖維細(xì)胞密度、膠原纖維沉積程度，Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β表達(dá)水平皆有所降低，說明駐極體在抑制增生性瘢痕的生長方面有一定的促進(jìn)作用，這可能與駐極體產(chǎn)生的外靜電場能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移并改善創(chuàng)面組織微循環(huán)、降低炎癥反應(yīng)的作用有關(guān)。同時，由于正極性駐極體對皮膚組織中藥物儲量的調(diào)控作用，與5-FU結(jié)合后應(yīng)用于瘢痕組織取得的效果更優(yōu)。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)在瘢痕的形成過程中扮演著重要的角色，能夠促進(jìn)血管生成和成纖維細(xì)胞的增殖，并且促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白；同時TGF-β通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1)的表達(dá)和活性、促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP1)的表達(dá)，從而抑制膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的降解，因此，TGF-β被認(rèn)為是影響創(chuàng)面愈合和瘢痕生長的重要因子之一。

本實(shí)驗通過免疫組化方法對各組瘢痕組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β的表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-FU貼劑和正極性駐極體5-FU貼劑作用后，三者的表達(dá)量都有顯著下降，且正極性駐極體5-FU貼劑組降低程度更大，說明5-FU貼劑和正極性駐極體5-FU貼劑通過降低瘢痕組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β的表達(dá)量從而抑制增生性瘢痕的生長，且正極性駐極體5-FU貼劑抑制增生性瘢痕生長的效果優(yōu)于5-FU貼劑。

4 結(jié)論

通過實(shí)驗得出以下結(jié)論：①正極性駐極體在抑制增生性瘢痕的生長方面有一定的促進(jìn)作用。②5-FU貼劑和正極性駐極體5-FU貼劑通過減少瘢痕組織內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β的表達(dá)量，抑制增生性瘢痕的生長。③正極性駐極體與5-FU聯(lián)用抑制增生性瘢痕的生長效果更好。