星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化意大利牛舌草總皂苷提取工藝

萬琪臻， 張文文， 滕 亮， 馬桂芝

(1新疆醫(yī)科大學藥學院， 烏魯木齊 830011； 2新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部, 烏魯木齊 830054)

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)為紫草科多年生草本植物[1-2]，主要含有皂苷、黃酮、生物堿等成分[3-4]，具有抗炎、抗?jié)儭⒖寡趸?、抗流感病毒、抗癌等藥理作用[5-8]，對心腦血管疾病具有良好的治療作用[9]。本課題組前期研究表明意大利牛舌草具有抗心肌缺血再灌注損傷的作用。本研究以單因素試驗為基礎(chǔ)，采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法(central composite design，CCD)優(yōu)選意大利牛舌草總皂苷提取工藝，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器AB135-S型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)，UV-2700型紫外分光光度儀(日本島津公司)，KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器公司)，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，WLY-200型高速多功能粉碎機(上海夢祥電器有限公司)，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)，HHS21-6電熱恒溫水浴鍋(上?，槴\實驗設(shè)備有限公司)。

1.2試藥齊墩果酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號HA0820KA14)，無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司，批號20170701)，甲醇(天津市百世化工有限公司，批號20120402)，冰乙酸(天津市富宇精細化工有限公司，批號120920)，香草醛(天津市光復(fù)精細化工研究所，批號20130712)，高氯酸(天津市鑫源化工有限公司，批號20140909)，高氯酸(天津市政成化學制品有限公司，批號20180401)，蒸餾水(實驗室自制)，試劑均為分析純。

1.3藥材意大利牛舌草2018年4月購于新疆伊鼎輝煌生物有限公司，經(jīng)由新疆醫(yī)科大學藥學院帕麗達·阿布力孜教授鑒定為紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備稱取齊墩果酸對照品適量于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成濃度為0.12 mg/mL的對照品溶液，備用。

2.2供試品溶液的制備稱取意大利牛舌草粉末(過40目篩)5.0 g，置于圓底燒瓶中，加80%乙醇60 mL，80℃回流提取，濾過，量取0.1 mL濾液置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，備用。

2.3標準曲線的制備分別吸取“2.1”項下對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，量取對照品溶液1 mL，置于具塞試管中，水浴蒸干后加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70℃反應(yīng)15 min，冰浴冷卻2 min后加入冰乙酸5 mL，搖勻，于547 nm處測定吸光度。以對照品濃度(X)為橫坐標、吸光度(Y)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.009 7X+0.021(r=0.999 5)，在7.22～65.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4單因素試驗

2.4.1 乙醇濃度對意大利牛舌草總皂苷提取含量的影響 稱取牛舌草粉末(過40目篩)5份，每份5.0 g，置于圓底燒瓶中，分別加入100%、95%、80%、60%、40%乙醇60 mL于80℃回流1 h，濾過，分別量取 0.1 mL藥液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.3”項下方法測定樣品中總皂苷的含量。當乙醇濃度為80%時，提取液中意大利牛舌草總皂苷含量達到最大值，故選擇80 %乙醇為提取溶劑，見圖1 A。

2.4.2 液料比對意大利牛舌草總皂苷提取含量的影響 稱牛舌草粉末(過40目篩)5份，每份5.0 g，置于圓底燒瓶中，用80%乙醇按液料比為4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1(mL∶g)于80℃回流1 h，濾過，分別量取0.1 mL濾液于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.3”項下測定樣品中總皂苷的含量。當液料比為12∶1時，提取液中意大利牛舌草總皂苷含量達到最大值，故選擇液料比為12∶1，見圖1B。

2.4.3 提取時間對意大利牛舌草總皂苷提取含量的影響 稱牛舌草粉末(過40目篩)5份，每份5.0 g，置于圓底燒瓶中，用80%的乙醇60 mL于80℃分別回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，濾過，分別量取 0.1 mL濾液于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.3”項下測定樣品中總皂苷的含量。當回流1 h時，提取液中意大利牛舌草總皂苷含量達到最大值，故選擇1 h為最佳回流時間，見圖1 C。

2.4.4 提取次數(shù)對意大利牛舌草總皂苷提取含量的影響 稱取牛舌草粉末(過40目篩)3份，每份5.0 g，置于圓底燒瓶中，加入12倍量80%的乙醇于80℃回流1 h，分別回流1、2、3次，濾過，分別量取 0.1 mL濾液于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.3”項下測定樣品中總皂苷的含量。當提取次數(shù)為2次時，提取液中意大利牛舌草總皂苷的含量高于提取1次，提取3次與提取2次，意大利牛舌草提取液中總皂苷含量無明顯差異，故選擇2次為最佳提取次數(shù)，見圖1D。

2.5星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化意大利牛舌草總皂苷提取工藝

2.5.1 試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化意大利牛舌草總皂苷提取工藝。根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定乙醇濃度(A)、液料比(B)作為星點設(shè)計考察因素，星點設(shè)計-響應(yīng)面法的因素水平，見表1。

乙醇體積分數(shù)/% 液料比/(mL∶g) 提取時間/h 提取次數(shù)/次

圖1 各因素對意大利牛舌草總皂苷提取含量的影響

2.5.2 模型的建立和方差分析結(jié)果 采用Design Expert 8.06軟件對試驗結(jié)果進行方差分析和多元二次回歸擬合，得到的回歸方程：Y=197.21-0.17A+21.27B+ 3.38AB-57.76A2-14.26B2，模型極顯著(P<0.01)，模型R2=0. 999 3，調(diào)整R2(Adj)=0.998 9表明該模型能解釋99.93%響應(yīng)值變化，即該模型與實際試驗擬合較好，失擬相P=0.068 2>0.05，不顯著，見表2。

表2 意大利牛舌草總皂苷含量回歸方程方差分析結(jié)果

2.5.3 響應(yīng)面分析結(jié)果 由等高線圖及響應(yīng)面圖可直觀了解各因素之間兩兩交互作用對總皂苷提取效果的影響。當液料比不變，隨著乙醇濃度的增加，總皂苷的含量先增加后降低；乙醇濃度不變，隨著液料比的增加，總皂苷的含量增加緩慢。沿液料比方向的等高線密度變化相對乙醇濃度方向高，說明液料比對總皂苷的提取影響大于乙醇濃度。比較各因素的F值也可知各因素試驗結(jié)果影響的大小順序為：B>A，即液料比>乙醇濃度。經(jīng)響應(yīng)面設(shè)計分析，意大利牛舌草總皂苷較優(yōu)提取條件為：14倍量80%乙醇，80℃回流提取2次，每次30 min，預(yù)測總皂苷含量為205.16 mg/g，見表3、圖2、3。

表3 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果(n=13)

2.6驗證試驗稱牛舌草粉末(過40目篩)3份，每份5.0 g，置于圓底燒瓶中，加80 %乙醇70 mL，回流提取2次，每次30 min，過濾，按“2.3”項下方法測定樣品中總皂苷含量分別為：201.53、203.42、204.17 mg/g，平均含量為(203.04±1.36)mg/g(RSD=0.67%)，與預(yù)測值之間的相對誤差為1.04%，表明所建立的模型具有良好的預(yù)測性。

3 討論

星點設(shè)計-響應(yīng)面法是優(yōu)選制備工藝的常用方法[10-13]，采用非線性數(shù)學模型進行擬合，復(fù)合相關(guān)系數(shù)較高，且在中心點進行重現(xiàn)性試驗以提高試驗精度，與優(yōu)選制備工藝的常用方法-正交設(shè)計法和均勻設(shè)計法相比，試驗精度更高，預(yù)測值更接近真實值，且操作簡便、試驗次數(shù)也較少，在試驗設(shè)計中更具優(yōu)勢[14-15]。

本研究單因素試驗結(jié)果提示乙醇濃度、液料比對意大利牛舌草總皂苷的提取含量有較為顯著的影響，乙醇濃度的影響大于液料對總皂苷含量的影響。星點設(shè)計-響應(yīng)面法的結(jié)顯提示對意大利總皂苷提取含量的影響液料比>乙醇體積分數(shù)，存在這種差異主要是因為單因素試驗中假定各因素之間為獨立因素，不存在交互作用，而星點設(shè)計-響應(yīng)面法則考慮到了各因素間可能存在的交互作用，星點設(shè)計-響應(yīng)面法方差分析亦表明液料比與乙醇濃度的交互作用極顯著，說明液料比與乙醇濃度存在交互作用。同時星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選工藝所得意大利牛舌草總皂苷提取量高于單因素試驗所得意大利牛舌草總皂苷提取量的最大值，亦驗證了星點設(shè)計-響應(yīng)面法可用來分析各因素對意大利牛舌草總皂苷提取工藝的影響，該方法準確、可行、預(yù)測性好。