不同酶對(duì)牛骨素?zé)岱磻?yīng)香精氣味及滋味的影響

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(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048; 2.湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司,湖南常德 415401)

在經(jīng)過(guò)物理方法的處理后,清湯型骨素的蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)比鮮骨要高,可以達(dá)到35%,而鮮骨中僅有11%左右。目前,骨素在食品工業(yè)中有一定應(yīng)用,但因其風(fēng)味不突出,尚有待改進(jìn)。酶解法是常用的改善骨素風(fēng)味的方法,能夠?yàn)槔霉撬亻_(kāi)發(fā)復(fù)合型熱反應(yīng)香精提供反應(yīng)基料。對(duì)高溫蒸煮后的骨蛋白進(jìn)行酶解反應(yīng),能夠使蛋白質(zhì)長(zhǎng)鏈斷開(kāi),形成較短的肽段,還能生成更多親水性的小分子氨基酸,從而提高骨素產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6]。孫紅梅等[7]對(duì)比了雞骨素及其酶解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)所得到產(chǎn)物的風(fēng)味差異,最終確定熱反應(yīng)底物為雞骨素酶解液。肖作兵等[8]研究了胰蛋白酶對(duì)豬骨素的酶促水解,得到了酶解的最佳工藝條件為酶解時(shí)間7 h,溫度50 ℃,底物濃度為1∶1,pH7.5,加酶量0.7%。方端等[9]對(duì)酶法水解牛骨工藝進(jìn)行了研究,并對(duì)酶解液風(fēng)味進(jìn)行了感官鑒定,得到最優(yōu)方案:牛骨經(jīng)90 ℃水浴條件下預(yù)處理30 min后,底物濃度設(shè)定為1∶14,初始pH6.6,溫度為40 ℃,動(dòng)物蛋白酶與底物比10000 U/g的條件下,酶解牛骨粉2 h。李迎楠等[10]酶解牛骨采用復(fù)合動(dòng)物蛋白酶,其添加量為15 mg/g,酶解4 h;風(fēng)味蛋白酶添加量為10 mg/g,酶解2 h。目前研究多集中于酶解雞骨素[7,11]和豬骨素[8,12-14],直接酶解牛骨素的研究較少,對(duì)于不同酶酶解牛骨素制備美拉德反應(yīng)香精的氣味及滋味上的差異對(duì)比仍是空白。

本文采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),測(cè)定美拉德反應(yīng)香精中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),采用高效液相色譜儀測(cè)定氨基酸、核苷酸和肽分布等非揮發(fā)性呈味物質(zhì),闡述不同酶酶解對(duì)牛骨素制備美拉德反應(yīng)香精的風(fēng)味影響,進(jìn)而推動(dòng)骨素產(chǎn)品在食品工業(yè)上的應(yīng)用,以期提高牛骨素產(chǎn)品價(jià)值,滿(mǎn)足食品企業(yè)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清湯型牛骨素、牛肉酶解液、水解植物蛋白(HVP) 湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司;復(fù)合蛋白酶(Protamex,47500 U/g)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶500 MG(Flavourzyme,25000 U/g) 丹麥諾維信公司;木瓜蛋白酶PSM 500(60000 U/g) 比利時(shí)PSM有限公司;胰蛋白酶(豬胰,25000 U/g)、D-木糖、葡萄糖、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽、硫胺素(VB1) 源葉生物科技有限公司;呈味核苷酸二鈉(I+G) 廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司;C7～C30系列烷烴、2-甲基-3-庚酮、混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品(5′-CMP、5′-GMP、5′-IMP和5′-AMP)、肽標(biāo)準(zhǔn)品(甘氨酸、抑肽酶、細(xì)胞色素C、桿菌肽、谷胱甘肽) 美國(guó)Sigma公司。

賽多利斯BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,JI-1精密增力電動(dòng)攪拌器 國(guó)華電器有限公司;YX-18DJ型YX系列手提式壓力滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS) 美國(guó)Supelco公司;7890A-7000B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent 公司;Sniffer9000嗅聞儀 瑞士Brechbuhler公司;毛細(xì)管柱DB-wax及DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國(guó)J&W公司;1260高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;Zorbax Eclipse-AAA柱、Agilent Eclipse XDB-C18柱 美國(guó)Agilent公司;TSK G2000 SWXL柱 日本Tosoh公司;FOSS KJELTEC 8400半自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥Foss公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛骨素酶解液的制備 牛骨素中的基本化合物指標(biāo)見(jiàn)表7,參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]。選擇蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶500 MG、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶,以及四種酶的兩兩組合,在最適條件下酶解牛骨素,各骨素酶解條件見(jiàn)表1。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)證明,在最適條件下,分步加酶與雙酶在兩種酶較優(yōu)酶解條件下共同酶解的水解度差別并不大,這是由于骨素中鹽含量高,導(dǎo)致各類(lèi)酶的酶解進(jìn)程較為困難,各組酶解液的水解度差異較小。而且分步酶解用時(shí)近8 h,不符合大多數(shù)企業(yè)的工業(yè)化生產(chǎn)要求,過(guò)長(zhǎng)的酶解時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致脂類(lèi)物質(zhì)的氧化哈敗和異味物質(zhì)增多的現(xiàn)象發(fā)生。為了簡(jiǎn)化工業(yè)生產(chǎn)步驟,統(tǒng)一采取共同的酶解方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。兩種酶不同的溫度則選擇兩種酶最佳酶解溫度范圍內(nèi)的溫度與pH,保證兩種酶都能夠進(jìn)行酶解工作。在錐形瓶中準(zhǔn)確稱(chēng)取100 g牛骨素,加酶后放入水浴鍋中,利用精密增力電動(dòng)攪拌器進(jìn)行攪拌,充分酶解后在90 ℃水浴滅酶10 min,冰浴冷卻降溫后,立即進(jìn)行水解度的測(cè)定及熱反應(yīng)香精的制備。為了圖表直觀性,統(tǒng)一采用S1～S10代表各種不同酶酶解得到的牛骨素酶解液制備出的熱反應(yīng)香精,酶和酶組合簡(jiǎn)寫(xiě)見(jiàn)表1。

表7 牛骨素中基本化合物含量表Table 7 The content of basic substances in bovine bone extract

表1 酶解牛骨素條件表Table 1 The condition of enzymatic hydrolysis of bovine bone extract

1.2.2 熱反應(yīng)香精的制備 通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)[18-19],并進(jìn)行前期預(yù)實(shí)驗(yàn),得到美拉德反應(yīng)配方如下:牛骨素酶解液30 g,蒸餾水14 g,牛肉酶解液6 g,葡萄糖0.5 g,木糖1 g,半胱氨酸0.5 g,半胱氨酸鹽酸鹽0.4 g,VB10.5 g,HVP 5 g,I+G 0.5 g,在120 ℃熱反應(yīng)60 min。熱反應(yīng)結(jié)束后,冰浴冷卻降溫后,在4 ℃冰箱儲(chǔ)存24 h后進(jìn)行氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜及高效液相色譜分析。

家庭是構(gòu)成社會(huì)的基本元素，家庭的生存狀態(tài)是社會(huì)發(fā)展水平的標(biāo)志。以往的城鄉(xiāng)規(guī)劃關(guān)注企業(yè)勝于關(guān)注家庭，關(guān)注勞動(dòng)力資源勝于關(guān)注勞動(dòng)者本身。大量農(nóng)民工的出現(xiàn)，導(dǎo)致了農(nóng)村家庭的碎片化和離散化、留守人群關(guān)愛(ài)的缺失，以及遠(yuǎn)程通勤造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和資源的浪費(fèi)等等。城鄉(xiāng)規(guī)劃應(yīng)從家庭的完整性、聚合性和生活質(zhì)量方面，對(duì)就業(yè)、居住和公共服務(wù)進(jìn)行規(guī)劃，使城鄉(xiāng)聚落適宜于家庭生活，而非人口和勞動(dòng)力集聚的空間。

1.2.3 水解度(DH)的測(cè)定 氨基酸態(tài)氮采用甲醛滴定法進(jìn)行測(cè)定[20]。準(zhǔn)確吸取5 mL酶解液至容量瓶,稀釋至100 mL,取20 mL稀釋液加入60 mL蒸餾水混勻,在磁力攪拌器進(jìn)行攪拌狀態(tài)下,用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至pH=8.2,加入10 mL甲醛溶液后繼續(xù)滴定至pH=9.2,記錄消耗的NaOH溶液體積。80 mL蒸餾水在相同條件下進(jìn)行滴定,作為空白溶液。溶液中氨基酸態(tài)氮含量的計(jì)算公式為：

式中:x為溶液中氨基酸態(tài)氮的含量(g/100 g);V1為滴定樣品時(shí)pH從8.2～9.2所消耗的NaOH溶液體積(mL);V2為滴定空白溶液時(shí),pH從8.2～9.2所消耗的NaOH溶液體積(mL);V3為參與反應(yīng)的稀釋液體積(mL);C為NaOH溶液濃度(C=0.05 mol/L)。

總蛋白質(zhì)含量通過(guò)FOSS半自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定[21]。消化程序?yàn)?00 ℃消化30 min,升溫至420 ℃消化1 h。水解度的計(jì)算公式為：

DH(%)=(氨基酸態(tài)氮含量/總蛋白質(zhì)含量)×100

1.2.4 感官評(píng)價(jià) 感官鑒評(píng)小組由北京工商大學(xué)分子感官科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的12名成員(6男6女,年齡20～50歲)組成,每名小組成員均接受過(guò)至少400 h的感官訓(xùn)練,并且均具有評(píng)價(jià)牛肉香精的經(jīng)驗(yàn),感官訓(xùn)練標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法見(jiàn)表2。通過(guò)小組成員討論,肉味香精選擇從氣味及滋味兩方面進(jìn)行評(píng)價(jià),其中氣味包括肉香、烤香、焦糖香、焦糊味、硫臭味、腥味、酸味共7項(xiàng)指標(biāo);滋味包括酸味、甜味、苦味、鮮味、醇厚感和后味共6項(xiàng)指標(biāo),氣味及滋味評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3及表4。樣品用蒸餾水稀釋50倍,并打亂序號(hào),用水浴鍋調(diào)整樣品溫度至37 ℃,品評(píng)員對(duì)樣品進(jìn)行描述性風(fēng)味感官鑒評(píng)并打分。感官指標(biāo)的評(píng)分采用10分制,0分代表未感知,10分代表極強(qiáng)烈,強(qiáng)度逐漸增加[22]。

表2 感官訓(xùn)練標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法Table 2 The preparation method of standard solution for sense training

表3 氣味感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表(分)Table 3 Sensory evaluation standard for flavor(score)

表4 滋味感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表(分)Table 4 Sensory evaluation standard for taste(score)

1.2.5 揮發(fā)性香氣化合物的提取、定性和定量

1.2.5.1 揮發(fā)性香氣化合物的提取 采用固相微萃取(solid-phase micro-extraction,SPME)方法對(duì)10種熱反應(yīng)香精的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進(jìn)行提取。在40 mL頂空瓶中加入10 g樣品,并打入濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮溶液1 μL作為內(nèi)標(biāo)物,混勻后密封。將樣品置于55 ℃水浴中平衡20 min,插入固相微萃取纖維頭(DVB/CAR/PDMS),頂空吸附40 min。萃取結(jié)束后,立即將萃取頭插入氣相色譜儀前進(jìn)樣口中進(jìn)行熱解析,于250 ℃條件下解析5 min進(jìn)樣。

兩種不同極性的毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)被用來(lái)進(jìn)行化合物的分離與驗(yàn)證,包括DB-wax(極性柱)和DB-5(非極性柱)。升溫程序如下:初始溫度40 ℃保持3 min,以5 ℃/min 升溫到200 ℃,再以10 ℃/min升溫到230 ℃,保持3 min,共41 min。載氣為氦氣,流速1.2 mL/min,不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件:電子轟擊(electron impact,EI)離子源,電子能量為70 eV,傳輸線(xiàn)溫度280 ℃,四極桿溫度150 ℃,離子源溫度230 ℃,質(zhì)量掃描范圍m/z為40～450 amu。GC-O溫度設(shè)定為200 ℃,嗅聞過(guò)程中有濕潤(rùn)蒸氣與氣味物質(zhì)一起通過(guò)嗅聞口進(jìn)入鼻腔,以降低干燥空氣對(duì)鼻腔粘膜的傷害,每組嗅聞?dòng)?名以上嗅聞人員單獨(dú)進(jìn)行嗅聞實(shí)驗(yàn),氣味描述記錄為每種氣味活性化合物至少三名嗅聞人員的相同描述。

1.2.5.2 揮發(fā)性香氣化合物的定性分析 通過(guò)3種方法共同對(duì)未知揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行定性分析,對(duì)揮發(fā)性香氣化合物的RI值進(jìn)行計(jì)算,并與文獻(xiàn)報(bào)道的氣味化合物保留指數(shù)(retention index,RI)[23]對(duì)比,NIST14軟件質(zhì)譜譜庫(kù)檢索,并進(jìn)行嗅聞數(shù)據(jù)對(duì)比。RI值的計(jì)算公式如下。

式中,N為待測(cè)氣味化合物a左側(cè)出峰的正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù);n為a兩側(cè)的兩個(gè)烷烴之間相差的碳原子數(shù)(n=1);tR為相應(yīng)化合物的保留時(shí)間。

1.2.5.3 揮發(fā)性香氣化合物的定量分析 本實(shí)驗(yàn)只需對(duì)比定量關(guān)系,因此選取內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析。

其中,Ci為被測(cè)化合物濃度(μg/μL);Cis為內(nèi)標(biāo)濃度(μg/μL);Ai為未知化合物的色譜峰面積;Ais為內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積。

1.2.6 氨基酸的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)采用Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行16種游離氨基酸(Asp、Ser、Glu、Gly、His、Thr、Ala、Tyr、Arg、Cys、Met、Val、Phe、Leu、Ile、Lys)的定量分析檢測(cè),分離柱為Zorbax Eclipse-AAA,酶解液與香精樣品按1∶5 (v/v)以超純水稀釋,通過(guò)0.22 μm濾膜后,采用Henderson等[24]的方法,利用OPA和FMOC柱前衍生法進(jìn)行測(cè)定。將16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)試劑(1 nmol/μL)將氨基酸用0.1 mol/L HCl稀釋配制成不同濃度的混標(biāo)進(jìn)樣,分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算各氨基酸濃度。

高效液相色譜(HPLC)條件:采用Zorbax Eclipse-AAA(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:鹽相A:40 mmol·L-1NaH2PO4的水溶液,用NaOH調(diào)至pH7.8;有機(jī)相B:甲醇-乙腈-水溶液(45∶45∶10,V/V/V)。流速為1 mL/min。進(jìn)樣量為1 μL。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為338 nm。柱溫設(shè)置為40 ℃。

1.2.7 核苷酸的測(cè)定 核苷酸的測(cè)定參考Cho等[25]的方法,采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,外標(biāo)法定量。酶解液與香精樣品按1∶5 (v/v)以超純水稀釋,通過(guò)0.22 μm濾膜。

HPLC條件:流動(dòng)相:鹽相A:40 mmol/L KH2PO4,用H3PO4調(diào)pH=3.8;有機(jī)相B:10%甲醇-水溶液,流速為1 mL/min。進(jìn)樣量為1 μL。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。柱溫設(shè)置為35 ℃。

1.2.8 肽分布的測(cè)定 采用凝膠色譜柱TSK gel G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm,5 μm)對(duì)樣品的肽分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定。選用的標(biāo)準(zhǔn)品包括甘氨酸(75Da)、谷胱甘肽(307 Da)、細(xì)胞色素C(885 Da)、桿菌肽(1423 Da)、抑肽酶(6512 Da),制作分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),以確定肽分子質(zhì)量大致分布。

HPLC條件:流動(dòng)相:20%乙腈水溶液,用甲酸調(diào)整pH3.0。流速0.5 mL/min。進(jìn)樣量1 μL。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。柱溫設(shè)置為25 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯多量程試驗(yàn)(Duncan’s multi-range test),每個(gè)實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶對(duì)牛骨素酶解液水解度(DH)及感官評(píng)價(jià)的影響

熱反應(yīng)香精的感官評(píng)價(jià)與DH的關(guān)系見(jiàn)圖1。從圖1中可以得到,S5(復(fù)合蛋白酶+復(fù)合風(fēng)味蛋白酶)、S6(復(fù)合蛋白酶+胰蛋白酶)、S10(胰蛋白酶+木瓜蛋白酶)這三種組合酶解得到的DH較高,四種單酶酶解DH差別不大,在這四種酶中,復(fù)合風(fēng)味蛋白酶為內(nèi)切酶,其余三種均為外切酶,外切酶與內(nèi)切酶的組合中,復(fù)合風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶配合最好,DH最高,而與胰蛋白酶和木瓜蛋白酶配合,均降低了DH。這可能由于只有復(fù)合蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解條件最相似,能夠發(fā)揮最大功效,能夠配合發(fā)揮其最大效果。同時(shí),DH的升降也與感官評(píng)價(jià)得分的高低呈現(xiàn)相似的趨勢(shì),通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn),牛骨素DH在10%～15%范圍內(nèi),制備出的熱反應(yīng)香精風(fēng)味最佳,在該范圍內(nèi),DH越高,感官評(píng)分也越高,復(fù)合蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的組合氣味和滋味總分最高。

圖1 不同酶對(duì)牛骨素水解度(DH)與美拉德反應(yīng)香精感官評(píng)價(jià)的影響Fig.1 The influence of different enzymes on degree of hydrolysis of bovine bone extract and sensory evaluation for Maillard reaction flavorings

2.2 不同酶對(duì)熱反應(yīng)香精揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響

由于測(cè)定酶解液揮發(fā)性風(fēng)味成分意義較小,故本實(shí)驗(yàn)針對(duì)10種酶解液制備的熱反應(yīng)香精進(jìn)行了固相微萃取協(xié)同GC-O-MS進(jìn)行分析,共得到64種氣味物質(zhì)。對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),可以發(fā)現(xiàn),10種香精中呈現(xiàn)烤香味、肉香、焦糖香等典型的牛肉香精風(fēng)味物質(zhì)的總量如表中最后一行所示,這些物質(zhì)包括文獻(xiàn)中已有報(bào)道的甲硫氨酸的Strecker降解醛3-甲硫基丙醛(煮土豆味)[26-27];脂肪氧化降解產(chǎn)物正辛醛和壬醛(脂味)[26-28];含硫氨基酸-半胱氨酸降解及美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的2-乙酰噻唑(烤香味)[26-27];半胱氨酸降解產(chǎn)生的硫化氫和還原糖脫水產(chǎn)物5-甲基-4-羥基-3(2H)呋喃酮反應(yīng)所形成的2-甲基-3-呋喃硫醇(肉味)[29-30];半胱氨酸降解釋放H2S,參與到美拉德反應(yīng)中形成呈肉香的揮發(fā)性含硫化合物糠硫醇(烤香味)[26-27];由2-甲基-3-呋喃硫醇形成的二硫醚類(lèi)物質(zhì)雙(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚(烤肉味)[26-27]等。除此之外,還包括呈現(xiàn)強(qiáng)烈烤香的2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2,3-二甲基哌嗪,呈現(xiàn)焦糖香氣的甲基麥芽酚,這些物質(zhì)對(duì)于牛肉香精天然柔和的肉味和烤香、焦糖香氣都有不可或缺的作用,故也計(jì)算在內(nèi),作為計(jì)算肉味香精典型香氣化合物含量指標(biāo)。在典型肉味香精香氣含量對(duì)比中,含量最高的是S9(復(fù)合風(fēng)味蛋白酶+木瓜蛋白酶)的組合,高達(dá)75.49 ng/g,S5(復(fù)合蛋白酶+復(fù)合風(fēng)味蛋白酶)組合含量居第二位,達(dá)到68.27 ng/g。在四種單酶肉味香精中S4(木瓜蛋白酶)牛骨素酶解液美拉德反應(yīng)后肉香味物質(zhì)含量較高,達(dá)到31.71 ng/g;S1(復(fù)合蛋白酶)酶解制得香精的肉香味物質(zhì)含量是最低的,僅9.32 ng/g。

表5 10種不同酶酶解制備熱反應(yīng)香精揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-O-MS分析結(jié)果Table 5 GC-O-MS analysis of volatile flavor compounds in the preparation of thermal reaction flavor by 10 different enzymes

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

2.3 非揮發(fā)性呈味物質(zhì)分析

2.3.1 不同酶對(duì)氨基酸及滋味活性值(TAV,Taste active value)的影響 滋味活性值為樣品中測(cè)定的滋味化合物濃度與其在水中或簡(jiǎn)單的溶解基質(zhì)中測(cè)量的閾值之比,TAV>1認(rèn)為該化合物具有滋味活性[31]。滋味閾值數(shù)據(jù)通過(guò)查閱文獻(xiàn)得到[32]。熱反應(yīng)香精氨基酸分析結(jié)果及TAV值對(duì)比見(jiàn)表6。圖2～圖4展示了美拉德反應(yīng)香精與酶解液中呈現(xiàn)鮮味、甜味與苦味氨基酸的對(duì)比,蛋白酶單獨(dú)酶解及其與其他酶共同酶解的三種組合中,單獨(dú)利用復(fù)合蛋白酶(S1)酶解得到的酶解液中鮮味氨基酸含量是最少的,當(dāng)加入了木瓜蛋白酶之后,二者共同酶解(S7)使美拉德反應(yīng)香精鮮味氨基酸大大增加,達(dá)到1.02 g/L,復(fù)合蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶組合(S5)對(duì)改善滋味也大有益處,美拉德反應(yīng)香精鮮味氨基酸達(dá)到0.99 g/L;苦味氨基酸總量中,復(fù)合風(fēng)味蛋白酶單獨(dú)酶解得到的酶解液,其苦味氨基酸含量遠(yuǎn)高于其他,在配合了其他酶之后,苦味氨基酸含量大大降低。在10種香精的制備過(guò)程中,均加有半胱氨酸和半胱氨酸鹽酸鹽,這兩種氨基酸作為美拉德反應(yīng)的重要前體物,是制備熱反應(yīng)香精過(guò)程中所必需的,但由于半胱氨酸無(wú)味感,故對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響。復(fù)合蛋白酶+木瓜蛋白酶組合(S7)的鮮味氨基酸含量是最多的,但與此同時(shí),苦味氨基酸含量也很高,所以對(duì)整體味感的平衡有所破壞,同樣鮮味氨基酸也較高的復(fù)合風(fēng)味蛋白酶+木瓜蛋白酶的組合也是苦味氨基酸含量高,對(duì)比發(fā)現(xiàn),復(fù)合蛋白酶+復(fù)合風(fēng)味蛋白酶組合(S5)的鮮味氨基酸含量高,苦味氨基酸含量低,甜味氨基酸含量適中,制備出的香精味感圓潤(rùn)、柔和,是最佳的組合酶。

表6 不同酶制備牛骨素?zé)岱磻?yīng)香精的氨基酸及TAV分析結(jié)果Table 6 The analysis of content of amino acids and TAV in thermal flavorings made by different kinds of enzymes

圖2 不同酶對(duì)牛骨素酶解液與美拉德反應(yīng)香精中鮮味氨基酸含量的影響Fig.2 The influence of different enzymes on the content of umami-taste amino acids in bovine bone extract enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings

圖3 不同酶對(duì)牛骨素酶解液與美拉德反應(yīng)香精中甜味氨基酸含量的影響Fig.3 The influence of different enzymes on the content of sweet-taste amino acids in bovine bone extract enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings

圖4 不同酶對(duì)牛骨素酶解液與美拉德反應(yīng)香精中苦味氨基酸含量的影響Fig.4 The influence of different enzymes on the content of bitter-taste amino acids in bovine bone extract enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings

2.3.2 不同酶對(duì)核苷酸的影響 核苷酸含量對(duì)比如圖5所示,蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶組合(S5)中,不論是酶解液中,還是熱反應(yīng)香精中,其呈鮮味核苷酸含量均為最高,由表7中可以得到牛骨素中核苷酸含量并不豐富,僅0.136 g/L,經(jīng)過(guò)酶解后,各酶解液核苷酸含量均迅速增加,蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶組合(S5)核苷酸總量更是增加至0.530 g/L,約是未酶解骨素的4倍,其中S5香精中的核苷酸含量最高為15.69 g/L，這可能由于酶解過(guò)程破壞了牛骨素中的細(xì)胞,溶解出更多的核苷酸類(lèi)物質(zhì),這些核苷酸可以作為美拉德反應(yīng)前體物,產(chǎn)生更多的揮發(fā)性肉香味化合物和不揮發(fā)性滋味物質(zhì)[33]。

圖5 不同酶對(duì)美拉德反應(yīng)香精與酶解液中核苷酸含量對(duì)比組合圖Fig.5 The comparison of the content of taste-active nucleotides in enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings made by different enzymes

2.3.3 不同酶對(duì)肽分布的影響 經(jīng)酶解后生成的肽作為香味形成的重要前體物,可以與還原糖、氨基酸、脂肪酸和硫胺素等風(fēng)味前體物發(fā)生系列反應(yīng),不僅能產(chǎn)生特征香味,而且比起其他前體物參與的美拉德反應(yīng)所產(chǎn)生的揮發(fā)性芳香物質(zhì)更為豐富[34]。王然等[35]對(duì)谷胱甘肽-木糖美拉德反應(yīng)體系形成肉類(lèi)風(fēng)味的形成機(jī)制進(jìn)行了研究,結(jié)果表明谷胱甘肽在肉香味化合物產(chǎn)生過(guò)程中起了很大的作用。Lancker等[36]模擬了以賴(lài)氨酸的-NH2為N端的二肽與葡萄糖、甲基乙二醛和乙二醛發(fā)生的美拉德反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)生了吡嗪類(lèi)的混合芳香物質(zhì),而且與游離氨基酸參與的美拉德反應(yīng)相比,此二肽反應(yīng)產(chǎn)生的吡嗪等香味物質(zhì)更濃。文獻(xiàn)中提到,呈現(xiàn)鮮味和濃厚感的肽,大多在200～1000 Da[37-41],故本實(shí)驗(yàn)以<1000 Da肽分布作為指標(biāo),以探索酶種類(lèi)對(duì)肉味香精豐滿(mǎn)的口感的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明,酶解液中復(fù)合蛋白酶+木瓜蛋白酶(S7)酶解效果最差,其<1000 Da肽分布最低,僅10.15%;復(fù)合蛋白酶+復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(S5)效果最佳,達(dá)到33.73%。這些肽可以參與到Maillard反應(yīng)中,并且生成特征氣味物質(zhì),增加肉味香精的感官品質(zhì)。在香精中,<1000 Da肽分布最多的仍然為復(fù)合蛋白酶+復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(S5)組合,達(dá)到38.52%,制備的牛肉香精會(huì)由于小分子肽類(lèi)的存在而增加鮮味和濃厚感。綜上,復(fù)合蛋白酶+復(fù)合風(fēng)味蛋白酶組合(S5)亦是獲得呈味肽類(lèi)的最佳組合酶。

圖6 不同酶對(duì)牛骨素酶解液與美拉德反應(yīng)香精中<1000 Da肽分布的影響Fig.6 The influence of different enzymes on <1000 Da peptide distribution in enzymatic hydrolysate of bovine bone extract and Marillard reaction flavorings

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,復(fù)合蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶組合酶解牛骨素效果最佳,其制備香精感官評(píng)價(jià)得分最高,香精牛肉香氣突出,圓潤(rùn)柔和。揮發(fā)性氣味化合物方面,典型肉味香精風(fēng)味物質(zhì)達(dá)68.27 ng/g。滋味化合物中,鮮味氨基酸含量高達(dá)0.99 g/L,鮮味氨基酸含量在10種香精中排名第二,且苦味氨基酸含量低,味感平衡。復(fù)合蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶組合制備的香精核苷酸含量最高,達(dá)到15.69 g/L;<1000 Da肽分布占比38.52%。整體肉香濃郁、持久,口感圓潤(rùn)柔和,綜合各項(xiàng)指標(biāo),確定復(fù)合蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶為酶解牛骨素制備熱反應(yīng)香精的最佳組合酶。