響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶解制取赤霞珠葡萄汁工藝

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(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

赤霞珠(CabernetSauvignon)屬歐亞種,別名解百納[1],為釀酒葡萄,也可用以制汁,其出汁率高、糖度較高、酸度適當(dāng),酚類物質(zhì)含量高,具有典型的滋味和香氣為人所知[2]。

赤霞珠葡萄所含有的抗氧化活性功能成分物質(zhì)以多酚類化合物(花色苷)為主[3]。國(guó)內(nèi)外研究表明,在眾多的植物多酚中,葡萄多酚抗氧化清除自由基的能力最強(qiáng),其抗氧化能力為VE的50倍、VC的20倍。赤霞珠葡萄中存在的多酚類化合物包括花色苷類(花青素)、兒茶素類、原花色素類以及白藜蘆醇等,具有抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、抗變異性以及抗癌、抗過(guò)敏、預(yù)防高血壓、皮膚保健及美容等功能[4]。

赤霞珠葡萄的花色苷等酚類物質(zhì)含量雖然豐富,但主要存在于皮籽中,受果皮組織和細(xì)胞的束縛,傳統(tǒng)的處理方式很難將酚類物質(zhì)活性成分最大程度地促溶到汁中,造成了葡萄皮中的功效成分隨皮渣排出,形成資源浪費(fèi)。同時(shí),將葡萄果皮中的花青素等有效物質(zhì)溶出是制約赤霞珠葡萄汁產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的技術(shù)瓶頸。

葡萄皮細(xì)胞壁中含有果膠和纖維素等物質(zhì),致使細(xì)胞壁徹底破碎困難,果膠酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶復(fù)合可將果膠類、纖維素類等物質(zhì)充分降解,較單一酶處理,更有利于細(xì)胞壁破碎,提高出汁率[5],也有利于花色苷、原花青素等多酚類有效成分溶出。

本研究采用復(fù)合酶(果膠酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶)對(duì)赤霞珠葡萄果漿進(jìn)行處理,以葡萄汁的花色苷含量和出汁率為指標(biāo),研究不同酶解條件對(duì)葡萄汁的影響，并優(yōu)化獲得最佳的酶解工藝條件,同時(shí)用高效液相色譜法(HPLC)比較單一酶和復(fù)合酶分別處理對(duì)葡萄汁中原花青素含量的影響,旨在為葡萄汁的酶法處理工藝提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù),同時(shí)也為提高葡萄果汁的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠葡萄 摘自新疆五家渠地區(qū)新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄種植基地,無(wú)病蟲(chóng)害及腐爛果,果實(shí)大小均勻,可溶性固形物含量為24 °Brix。

果膠酶(10000 U/mL)、纖維素酶(700 U/mL)、β-葡聚糖酶(5000 U/mL) 天津諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司;原花青素標(biāo)品(>98%) 上海永葉生物科技有限公司;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純) 美國(guó)Sigma公司;3,5-二硝基水楊酸、結(jié)晶酚(分析純) 天津盛通泰化工有限公司;正丁醇、硫酸高鐵銨、氫氧化鈉、酚酞、鹽酸、氯化鉀、葡萄糖、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸、無(wú)水碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、無(wú)水乙醇(分析純) 天津光復(fù)科技有限公司;沒(méi)食子酸、福林酚(優(yōu)級(jí)純) 北京索萊寶科技有限公司。

FA2104N型分析天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;YP2002型電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TGL-16G型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;LC-16型高效液相色譜儀 日本島津公司;MYP11-2型恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;KUDOS型SK臺(tái)式超聲波處理機(jī) 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司;N-3000E型阿貝折光儀 上海卓鑫科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄汁加工工藝流程 將新鮮的赤霞珠葡萄洗凈后人工除梗、破碎、去籽,稱取250 g葡萄果漿于燒杯中,放置于4 ℃冰箱,在自然pH條件下,經(jīng)復(fù)合酶酶解處理后,壓榨,過(guò)濾,得到赤霞珠紅葡萄汁。

將上述所得紅葡萄汁于8000 r/min的條件下離心20 min,收集上清液備用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 復(fù)合酶添加量對(duì)葡萄出汁率和花色苷含量的影響 按照1.2.1方法所得葡萄汁,按果膠酶∶纖維素酶∶β-葡聚糖酶復(fù)合體積配比=1∶1∶1、酶解時(shí)間6 h,分別在復(fù)合酶添加量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%條件下進(jìn)行酶解,離心取上清液,計(jì)算葡萄出汁率并測(cè)定花色苷含量,確定最適復(fù)合酶添加量。

1.2.2.2 復(fù)合酶配比對(duì)葡萄出汁率和花色苷含量的影響 按照1.2.1方法所得葡萄汁,按復(fù)合酶添加量0.6%,酶解時(shí)間6 h,進(jìn)行酶解,分別在果膠酶:纖維素酶:β-葡聚糖酶復(fù)合體積配比0∶1∶1、1∶1∶0、1∶0∶1、1∶1∶1條件下,離心取上清液,計(jì)算葡萄出汁率并測(cè)定花色苷含量,確定最適復(fù)合酶配比。

1.2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)葡萄出汁率和花色苷含量的影響 按照1.2.1方法所得葡萄汁,按復(fù)合酶添加量0.6%、復(fù)合酶體積配比1∶1∶1,分別在酶解時(shí)間2、4、6、8、10 h條件下進(jìn)行酶解,離心取上清液,計(jì)算葡萄的出汁率并測(cè)定花色苷含量,確定最適酶解時(shí)間。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)復(fù)合酶解的單因素試驗(yàn)結(jié)果,以復(fù)合酶添加量、復(fù)合酶配比、酶解時(shí)間三個(gè)因素作為自變量,葡萄汁的出汁率和花色苷含量為響應(yīng)值,采用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)(見(jiàn)表1),優(yōu)化葡萄汁的酶解條件。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface analysis

1.2.4 不同酶解處理對(duì)葡萄汁花青素含量的影響 分別稱取4份250 g葡萄果漿,置于燒杯中,分別添加0.66%(m/V)的果膠酶、0.66%(m/V)的纖維素酶、0.66%(m/V)的β-葡聚糖酶、0.66%(m/V)的果膠酶:纖維素酶:β-葡聚糖酶復(fù)合體積配比(1∶1∶1),放置于4 ℃冰箱酶解6.3 h制備葡萄汁,經(jīng)紗布過(guò)濾后離心取上清液,測(cè)定原花青素含量,比較不同酶處理對(duì)葡萄汁中原花青素含量的影響。

1.3 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 出汁率的計(jì)算 取W g葡萄經(jīng)破碎,酶解,過(guò)濾后,稱取剩下的葡萄皮渣為W1g,按式(1)計(jì)算:

式(1)

式中,W為葡萄質(zhì)量,g;W1為葡萄皮質(zhì)量,g。

1.3.2 總酸含量的測(cè)定 電位滴定法,參照《釀酒檢測(cè)與分析》(第二版)[6]。

1.3.3 還原糖含量的測(cè)定 3,5-二硝基水楊酸(DNS)法,參照《果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[7]。

1.3.4 多酚含量的測(cè)定 Folin-Ciocalteus 法測(cè)定,參照《GB/T15038-2006》[8]。

1.3.5 花色苷含量的測(cè)定 pH示差法測(cè)定,參照楊兆艷[9]的方法。

取葡萄汁1.0 mL,分別用pH1.0和pH4.5的緩沖溶液定容至10.0 mL,置于暗處反應(yīng)1 h,用蒸餾水做空白,在520、700 nm處測(cè)定吸光度,根據(jù)Fuleki公式求出花色苷含量。

式(2)

式中,A為(A520 nmpH1.00-A700 nmpH1.00)-(A520 nmpH4.50-A700 nmpH4.50);MW為矢車(chē)菊花素-3-葡萄糖苷的分子量,449.2;DF為稀釋因子;ε 為矢車(chē)菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù),26900;L為光程,1 cm;W為葡萄質(zhì)量,g。

1.3.6 原花青素含量的測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制[10]:將20 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中,制成2 mg/mL的原花青素儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL儲(chǔ)備液,用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中。分別取1 mL溶液至于具塞試管中,加入0.2 mL硫酸高鐵銨溶液(用2 mol/L鹽酸水溶液溶解)和8.8 mL正丁醇,塞緊蓋子,搖勻,100 ℃水浴加熱1 h后取出，冷卻至室溫,正丁醇定容至10 mL,得到原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液,經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜后,進(jìn)行HPLC分析。

樣品制備:1 mL葡萄汁用甲醇定容置10 mL棕色容量瓶,從中取1 mL溶液于具塞試管,其余步驟與標(biāo)準(zhǔn)品溶液相同,最后經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜后直接上機(jī)。

HPLC條件[11]:Pgrandsil-STC-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),進(jìn)樣量20 μL,流速0.6 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,柱溫:室溫,流動(dòng)相:甲醇∶乙腈∶水=75∶20∶5;以原花青素質(zhì)量濃度(0.2～1.0 mg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均為獨(dú)立重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析,用OriginPro 8.5及Excel 97-2003軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶添加量的影響 由圖1可以看出,葡萄汁出汁率和花色苷含量隨著復(fù)合酶添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到0.6%時(shí),葡萄汁出汁率和花色苷含量達(dá)到最大,分別為81.2%和212.275 mg/L,隨后葡萄汁出汁率和花色苷含量開(kāi)始下降。這是因?yàn)殡S著復(fù)合酶添加量的增加,酶與果肉細(xì)胞反應(yīng)增多,胞內(nèi)物質(zhì)更容易溶出,葡萄汁出汁率和花色苷含量隨之不斷增大;當(dāng)復(fù)合酶添加量超過(guò)0.6%時(shí),葡萄果肉細(xì)胞過(guò)度酶解,造成多糖復(fù)合物解離,果汁中的糖類物質(zhì)增多,果汁黏度增大,阻礙酶解反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行,果汁出汁率隨之下降[12]。因此,選擇復(fù)合酶添加量0.6%較為合適。

圖1 復(fù)合酶添加量對(duì)葡萄汁出汁率和花色苷含量的影響Fig.1 Effect of compound enzyme dosage on yield and anthocyanin content of grape juice

2.1.2 復(fù)合酶配比的影響 由圖2可以看出,復(fù)合酶不同添加比例對(duì)葡萄汁出汁率和花色苷的含量影響比較明顯,當(dāng)復(fù)合酶體積配比為1∶1∶1時(shí),葡萄汁出汁率和花色苷含量達(dá)到最大,分別為81.4%和212.905 mg/L。這是因?yàn)閺?fù)合酶體積配比為1∶1∶1時(shí),水解環(huán)境中參與果膠反應(yīng)和纖維素水解反應(yīng)的酶分子均達(dá)到酶解結(jié)合反應(yīng)體系的穩(wěn)態(tài),改變復(fù)合酶配比則會(huì)打破這種穩(wěn)態(tài)的體系[13]。因此,選擇復(fù)合酶體積配比1∶1∶1較為適宜。

圖2 復(fù)合酶配比對(duì)葡萄汁出汁率和花色苷含量的影響Fig.2 Effect of compound enzyme proportion on yield and anthocyanin content of grape juice

2.1.3 酶解時(shí)間的影響 由圖3可以看出,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),葡萄汁出汁率和花色苷含量增大而后減小。酶解時(shí)間為6 h時(shí),葡萄汁出汁率和花色苷含量最大,分別為81.6%和212.597 mg/L。酶解時(shí)間增加可以促進(jìn)葡萄胞內(nèi)物的釋放,但是酶解時(shí)間超過(guò)6 h后并不能夠增加出汁率和花色苷含量,原因是隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),葡萄汁與空氣接觸,花色苷不穩(wěn)定易分解,含量呈先升高后降低趨勢(shì),從果汁營(yíng)養(yǎng)和口感方面考慮,酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)破壞嚴(yán)重,口感變差,同時(shí)也增加了果汁生產(chǎn)成本[14]。因此,選擇酶解時(shí)間6 h較為適宜。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)葡萄汁出汁率和花色苷含量的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield and anthocyanin content of grape juice

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 應(yīng)用Box-Behnken對(duì)赤霞珠葡萄制汁工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,分析具體試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)建立葡萄汁的出汁率(Y1)和花色苷含量(Y2)與復(fù)合酶添加量(A)、復(fù)合酶配比(B)、酶解時(shí)間(C)之間的回歸方程分別為:

Y1=83.22+2.42A+5.26B+0.66C+0.23AB+0.23AC+0.45BC-3.16A2-1.68B2-4.09C2

式(1)

Y2=240.67+2.14A+17.12B+2.72C+0.68AB+0.36AC+1.35BC-11.74A2-5.33B2-14.56C2

式(2)

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表3可知,在復(fù)合酶處理葡萄汁工藝參數(shù)中,在所選的各因素水平范圍內(nèi),影響葡萄汁出汁率的各因素按主次順序排列為:B>A>C,模型中B和C2的影響極顯著(p<0.01),A和A2的影響顯著(p<0.05),其他因素的影響均不顯著(p>0.05)。影響葡萄汁出汁率的各因素按主次順序排列為:B>C>A,模型中B、A2、B2和C2的影響極顯著(p<0.01),A和C的影響顯著(p<0.05),其他因素的影響均不顯著(p>0.05)。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 通過(guò)多元二次回歸模型得到響應(yīng)面圖,響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因素A、B、C所構(gòu)成的三維空間的曲面圖。在其他試驗(yàn)因素不變的情況下,考察交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響,響應(yīng)面分析圖可用于評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值影響的兩兩交互作用[15]。響應(yīng)面坡度越陡峭,表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)矫舾?該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大,反之則表明影響越小[16]。由圖4可知,交互項(xiàng)對(duì)出汁率和花色苷含量的影響中,各因素之間交互作用明顯。

圖4 出汁率和花色苷含量的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface graphs for the effects on yield and anthocyanin content of grape juice

2.2.4 最佳條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合,得到預(yù)測(cè)的復(fù)合酶處理的最佳工藝條件為復(fù)合酶添加量0.65%、復(fù)合酶配比1∶1∶1、酶解時(shí)間6.29 h,響應(yīng)面有最優(yōu)值,即出汁率的理論值為87.354%±0.149%,花色苷含量的理論值為(252.716±0.149) mg/L。為驗(yàn)證模型的有效性,考慮到實(shí)際情況,將最佳工藝條件修改為復(fù)合酶添加量0.66%、復(fù)合酶配比1∶1∶1、酶解時(shí)間6.3 h,在此工藝條件下,葡萄汁的出汁率為87.103%±0.471%,花色苷含量為(254.664±2.359) mg/L,說(shuō)明響應(yīng)值的實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合良好,證實(shí)了該模型的可靠性,進(jìn)一步說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)復(fù)合酶處理葡萄汁的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化是可行的。

2.3 酶處理對(duì)葡萄汁原花青素含量的影響

由圖5可知,原花青素標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為3.781 min。根據(jù)1.3.6原花青素含量的測(cè)定方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖6,得回歸方程y=13443.71457x+135.38191,R2=0.9995。

圖5 原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of proanthocyanidin standard solution

圖6 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of proanthocyanidins

由圖7可知,所得不同酶處理葡萄汁中原花青素的色譜峰尖銳,分離效率好,出峰時(shí)間都在3.8 min左右。根據(jù)圖7中的峰面積,代入回歸方程,得到原花青素含量。

圖7 不同酶處理葡萄汁中原花青素色譜圖Fig.7 The chromatographic diagram of origin proanthocyanidin of different enzyme treated grape juice

由圖8可知,復(fù)合酶處理葡萄汁的原花青素含量顯著高于單一酶處理(p<0.05),果膠酶處理葡萄汁的原花青素含量為0.172 mg/mL,纖維素酶處理葡萄汁的原花青素含量最小為0.105 mg/mL,且不同酶處理葡萄汁的原花青素含量之間存在顯著性差異(p<0.05)。原花青素是多酚化合物,主要存在于赤霞珠葡萄的果皮中,果膠酶可以水解細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙中的果膠,使細(xì)胞破裂,促使活性成分釋放,降低果汁粘度,提高出汁率和營(yíng)養(yǎng)成分[17],β-葡聚糖酶可以降解糖苷類化合物,同時(shí)還可以協(xié)助纖維素酶降解纖維素,纖維素酶可以使葡萄細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的纖維素、半纖維素發(fā)生降解,將三種酶復(fù)合使用可以促進(jìn)赤霞珠葡萄有效物質(zhì)原花青素的溶出[18]。

圖8 不同酶處理對(duì)葡萄汁原花青素含量的影響Fig.8 Effect of different enzyme treatments on the proanthocyanidin content of grape juice

3 結(jié)論

本研究以赤霞珠葡萄為原料,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù),得到最佳酶解工藝條件為:復(fù)合酶添加量0.66%、復(fù)合酶配比1∶1∶1、酶解時(shí)間6.3 h,在此工藝條件下,葡萄汁的出汁率為 87.103%±0.471%,花色苷含量為(254.664±2.359) mg/L,表明響應(yīng)面設(shè)計(jì)所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠,該模型可用于葡萄汁加工過(guò)程中葡萄色素溶出效果的分析與預(yù)測(cè)。

通過(guò)比較單一酶處理和復(fù)合酶處理葡萄汁的原花青素含量可知,復(fù)合酶處理葡萄汁的原花青素含量最大為0.224 mg/mL,顯著高于單一酶處理(p<0.05),所得實(shí)驗(yàn)值與理論值相對(duì)誤差小,說(shuō)明經(jīng)響應(yīng)面分析方法優(yōu)化獲得的工藝參數(shù)是可信的,具有較好的實(shí)用價(jià)值。