三種茶葉中多酚提取物的抑菌活性及其對致病菌膜滲透性的比較分析

, ,,,,紫薇

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所,黑龍江哈爾濱 150076)

茶葉在我國具有悠久的歷史,飲茶不僅可以提神醒腦還可以保健養(yǎng)生,深受人們的喜愛。茶多酚(Tea polyphenol,TP)是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱,又叫茶單寧或茶鞣質(zhì),主要包括黃烷醇(兒茶素)類、黃酮類、黃酮醇類、花色苷類和酚酸類等,其中兒茶素占60%～80%[1]。茶多酚是茶葉中有保健功能的主要成份之一[2-5],除具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、降脂、預(yù)防心血管疾病、護肝、抗衰老、調(diào)節(jié)綜合免疫能力等多種藥理作用外,還具有廣譜而強效的抗菌作用,具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[6]。

目前,人們對于茶多酚及其抗菌作用的研究主要是茶多酚抗菌特性的研究,集中在茶多酚抑菌的種類、抑菌效果與影響因素等[7]。茶多酚對多種典型食品致病菌及腐敗菌都有抑制作用,且與多種已知抗生素具有協(xié)同作用[7]。但是,對于不同種類茶葉的抑菌活性比較、茶多酚與細(xì)菌相互作用的研究還非常有限。另外,目前國內(nèi)外對于茶多酚抑菌機制尚不十分清楚,使得茶多酚的應(yīng)用缺乏科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo),很大程度上限制了茶多酚在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的進一步推廣。

由于生活在不同地域的人們對于茶葉的種類有所偏好,本文通過比較西湖龍井(綠茶)、鐵觀音(青茶)、普洱(黑茶)茶多酚的抑菌作用,并通過DNA滲透性實驗評價茶多酚對各種致病菌細(xì)胞膜完整性的影響,進一步提取基因組DNA觀察茶多酚提取物作用細(xì)菌前后對其DNA損傷的影響,并比較茶多酚提取物作用前后菌體蛋白和上清蛋白的變化,為茶多酚的深入研究和開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù),為人們保健茶飲的選擇及茶葉中活性成分的開發(fā)應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 8739)、金色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusATCC 6538);枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)、腸炎沙門氏菌(SalmonellaenteritidisATCC13076)、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 14442)、變異鏈球菌(StreptococcusmutansATCC 35668) 哈爾濱商業(yè)大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所保存;西湖龍井 杭州茶廠有限公司;鐵觀音 杭州憶江南茶葉有限公司;普洱茶 云南茶樹王茶葉有限公司;茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%) 西安玉泉生物科技有限公司;氨芐青霉素 Sigma;細(xì)菌DNA提取試劑盒、SDS、聚丙烯酰胺、1Kb DNA ladder 天根生物科技有限公司;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其它試劑 均為分析純。

FUSION FX5凝膠成像系統(tǒng) VILBER;SX-700型高壓滅菌鍋 TOMY;ELx800酶標(biāo)儀 BioTek;HALO DB-20紫外分光光度計 Dynamica;潔凈工作臺HDL北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司;BP-9082精密恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶多酚的提取及含量測定 采用熱水浸提法,茶葉干品經(jīng)粉碎機粉碎后,過80目篩,料液比1∶20 g/mL,80 ℃,浸提30 min,重復(fù)3次,合并提取液后抽濾除渣,取濾液用等體積氯仿萃取,上層為茶多酚水溶液層,下層為氯仿層,重復(fù)3次。氯仿相用乙酸乙酯萃取,將乙酸乙酯層通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(45 ℃，100 r/min)濃縮后揮發(fā),得到茶多酚浸膏粗品。

取茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品,配制濃度為0.1 mg/mL茶多酚溶液,分別取0、200、400、600、800 μL于容量瓶中,用蒸餾水定容至20 mL。再次稀釋,使茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.00025、0.0005、0.00075、0.001 mg/mL。以蒸餾水為對照,分別測得274 nm下的吸光光度值。以吸光度A對茶多酚標(biāo)準(zhǔn)的濃度繪制工作曲線,帶入所提取茶多酚的吸光度值求得濃度,并計算茶多酚的含量。茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=754.8x+0.017,R2=0.9997,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算茶多酚的濃度C。

式(1)

式中:M為茶葉粗粉質(zhì)量(g);C為茶多酚溶液濃度(mg/mL);V-茶多酚溶液體積(mL)。

1.2.2 茶多酚提取物抑菌活性的測定

1.2.2.1 抑菌圈的測定 采用濾紙片法對不同茶葉中茶多酚提取物進行抑菌活性研究。用打孔器將定性濾紙打成6 mm直徑的圓片,置于培養(yǎng)皿中滅菌,無菌條件下在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上涂布100 μL濃度107CFU/mL致病菌菌懸液,反復(fù)涂布3次使菌液涂布均勻,將浸泡30 min茶多酚提取液(4 mg/mL)的滅菌濾紙片擺放于培養(yǎng)基上,陽性對照為氨芐青霉素(0.4 mg/mL),37 ℃培養(yǎng)24 h后,觀察記錄結(jié)果,測量每一個抑菌圈的直徑[8]。

1.2.2.2 MIC和MBC的測定 最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,簡稱MIC),指能夠抑制細(xì)菌生長、繁殖的最低藥物濃度。通過二倍肉湯稀釋法,采用96孔板,對茶多酚提取物進行抑菌活性研究,將茶多酚提取物溶于生理鹽水,倍比稀釋,得到樣品濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL。分別加入105CFU/mL的致病菌,包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌、銅綠假擔(dān)孢菌、變異鏈球菌,37 ℃過夜培養(yǎng)12 h,觀察菌液生長情況,菌液透明澄清時所對應(yīng)的藥液濃度即為MIC[9],實驗重復(fù)3次。

最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration)簡稱MBC,指殺死99.9%的供試微生物所需的最低藥物濃度。MBC是根據(jù)MIC的測定結(jié)果,選取MIC、2MIC和4MIC對應(yīng)樣品的菌液,并點植于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃過夜培養(yǎng)12 h,觀察病原菌生長狀況,不生長菌落對應(yīng)的最低藥物濃度即為MBC[10]。

1.2.3 細(xì)胞膜滲透性實驗 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌、銅綠假擔(dān)孢菌、變異鏈球菌6種致病菌接種于營養(yǎng)肉湯于37 ℃ 120 r/min過夜培養(yǎng)至107CFU/mL,培養(yǎng)液經(jīng)12000 r/min,離心2 min,棄上清,沉淀用0.5% NaCl溶液洗滌、重懸。分別加入3種不同濃度的茶多酚提取物(0.5MIC、MIC、2MIC),空白對照加入等體積的0.5% NaCl,37 ℃培養(yǎng)8 h,12000 r/min,離心2 min,取上清。在260 nm下測量紫外分光光度值[11]。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 DNA損傷實驗 取過夜培養(yǎng)至107CFU/mL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液,12000 r/min,離心2 min,棄上清,菌體用0.5% NaCl洗滌、重懸后,加入不同濃度的茶多酚(0.5MIC、MIC、2MIC),充分混勻37 ℃培養(yǎng)12 h。用細(xì)菌DNA試劑盒提取基因組DNA。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測,凝膠成像系統(tǒng)觀察不同濃度茶多酚對致病菌基因組DNA的損傷作用[12]。

1.2.5 蛋白質(zhì)損傷及泄露實驗 取過夜培養(yǎng)至107CFU/mL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液,12000 r/min,離心2 min,棄上清,菌體用0.5% NaCl洗滌、重懸后,加入不同濃度的茶多酚(0.5MIC、MIC、2MIC),充分混勻37 ℃培養(yǎng)12 h。12000 r/min,離心2 min后,將菌體蛋白與上清蛋白分別加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)中,100 ℃水浴5 min,使之完全混合變性,用12%分離膠(1.5 mol/L Tris-HCl pH=8.8,10% SDS,10%過硫酸銨(APS),30 mol/L Tris-HCl,N,N,N,N四甲基乙二胺(TEMED),ddH2O)和4%濃縮膠(1.0 mol/L Tris-HCl pH=6.8,10% SDS,10% APS,TEMED,ddH2O)進行凝膠電泳。加樣后,100 V為起始電壓10 min后,120 V恒壓1 h,考馬斯亮藍R-250染色約15 min,再用脫色液脫色,觀察菌體及上清蛋白條帶變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理。采用ANOVA方差分析并行方差齊性檢驗;結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚的含量

根據(jù)茶多酚含量計算公式得出西湖龍井、鐵觀音和普洱茶的茶多酚的含量分別為(48.12±3.22)、(37.36±2.64)和(31.61±1.92) mg/g,其中西湖龍井中的茶多酚含量最高。

2.2 茶多酚提取物的抑菌活性

從表1可以看出,三種茶葉中茶多酚提取物均具有明顯的抑菌效果,其中西湖龍井抑菌效果最強,可通過進一步MIC和MBC的測定對抗菌效果進行評價。

表1 茶多酚提取物對致病菌抑菌直徑的影響(cm)Table 1 Effect of tea polyphenol extract on antipathogenic bacteria diameter(cm)

從綜合表1～表2中分析可知,3種茶葉茶多酚提取物均對6種常見致病菌具有較好的抑菌效果,其中西湖龍井與鐵觀音的抑菌效果最強,對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC值為0.125、0.125 mg/mL,MBC值為0.25、0.25 mg/mL。由于表1中顯示西湖龍井抑菌效果更明顯,對金黃色葡萄球菌抑菌直徑為(1.80±0.06) cm,結(jié)合抑菌圈直徑、MIC和MBC結(jié)果及茶多酚含量推測,抑菌效果與茶多酚的含量具有一定的相關(guān)性,隨著茶多酚含量的增加,抑菌效果更為明顯。后續(xù)實驗選取茶多酚含量較高的西湖龍井茶多酚提取物做進一步研究。

表2 茶多酚提取物的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)(mg/mL)Table 2 MIC and MBC value of tea polyphenol extract(mg/mL)

2.4 細(xì)胞膜滲透性試驗

選取西湖龍井茶多酚提取物為研究對象,通過對6種細(xì)菌培養(yǎng)物作用后,在260 nm下測量OD值,如圖1所示,在茶多酚的作用下,隨著藥物濃度的增加,260 nm處的以DNA為主滲透物質(zhì)含量逐漸升高,尤其是作用在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及變異鏈球菌中變化較為明顯。有報道顯示，兒茶素物質(zhì)可結(jié)合細(xì)胞膜的磷脂雙分子層,從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的破壞。細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞可削弱細(xì)菌與宿主細(xì)胞結(jié)合的能力,同時也抑制了細(xì)菌聚集結(jié)合形成生物膜,生物膜的形成與細(xì)菌的致病性和耐受性密切相關(guān)[13]。推測茶多酚提取物的抑菌作用與破壞細(xì)菌細(xì)胞膜并提高其滲透性有著一定的關(guān)聯(lián)。

圖1 茶多酚提取物的菌株DNA滲透性實驗Fig.1 DNA permeability test of tea polyphenol extract on strain

2.5 DNA損傷實驗

根據(jù)DNA滲透性實驗結(jié)果,選取西湖龍井茶多酚提取物為研究對象,作用于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌,經(jīng)藥物作用后提取基因組DNA,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加,無論是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌,其基因組DNA均呈現(xiàn)一定程度的彌散和降解,如圖2所示,推測茶多酚提取物可能通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜,進一步對細(xì)菌DNA造成損傷,進而發(fā)揮其抑菌作用。

圖2 茶多酚提取物的菌株DNA損傷實驗Fig.2 DNA damage test of tea polyphenol extract on strain注:1～5為1kbDNA marker,2MIC、MIC、0.5MIC、空白組金黃色葡萄球菌DNA;6～10為DNA marker,2MIC、MIC、0.5MIC、空白組大腸桿菌DNA。

2.6 蛋白質(zhì)損傷及泄露實驗

選取西湖龍井茶多酚提取物為研究對象,作用于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌,經(jīng)藥物作用后,隨著藥物濃度的增加,金黃色葡萄球菌的菌體蛋白出現(xiàn)一定程度的降解損傷,其中條帶a與條帶b可能對茶多酚更為敏感,蛋白表達具有較明顯的下降趨勢。隨著藥物濃度的增加,菌體上清蛋白中c條帶與d條帶具有表達上揚趨勢,但當(dāng)藥物濃度達到MIC以后,降解程度不再增加,說明菌體細(xì)胞膜隨藥物濃度增大逐漸發(fā)生損傷,引起菌體蛋白的泄露,當(dāng)藥物濃度達到一定值時,蛋白泄漏處于相對穩(wěn)定狀態(tài)(圖3A)。大腸桿菌的菌體蛋白隨藥物濃度有輕微的降解損傷,變化不明顯。在對菌體上清蛋白的觀察中發(fā)現(xiàn)e條帶、f條帶與g條帶出現(xiàn)一定的上揚趨勢,表明菌體上清蛋白出現(xiàn)一定程度的泄漏,尤其是當(dāng)藥物濃度達到MIC時,菌體蛋白泄漏程度最大,隨著藥物濃度繼續(xù)加大,反而蛋白質(zhì)泄漏不再增加(圖3B)。這一現(xiàn)象可能與革蘭氏陽性菌與陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌,其細(xì)胞壁存在外膜結(jié)構(gòu),對細(xì)菌細(xì)胞膜起到一定的保護作用。

圖3 茶多酚提取物的對菌體蛋白損傷及上清蛋白泄露實驗Fig.3 The experiment of tea polyphenol extract on protein-damage and supernatant leakage注:A中M:蛋白質(zhì)marker,1～4:2MIC、MIC、0.5MIC、空白組金黃色葡萄球菌菌體蛋白,1′-4′:0.5MIC、MIC、2MIC空白組金黃色葡萄球菌上清蛋白;B中M:蛋白質(zhì) marker,1-4:2MIC、MIC、0.5MIC、空白組大腸桿菌菌體蛋白,1′-4′:0.5MIC、MIC、2MIC空白組大腸桿菌上清蛋白。

3 討論

茶葉作為一種保健飲品有著悠久的歷史,不同的茶葉中其保健成分與保健效果也有著一定的差異。茶葉組成成分由于不同種類的茶葉發(fā)酵程度不同,其成分含量也不同。其中綠茶為不發(fā)酵茶,青茶為半發(fā)酵茶,黑茶為后發(fā)酵茶。在發(fā)酵過程中,由于酶的作用,使得茶葉中的一些成分發(fā)生氧化和降解。特別是茶葉中多酚類物質(zhì),由于酶的氧化逐漸產(chǎn)生茶紅素、茶黃素和茶褐素[14-17]。因此,對黑茶來說,茶色素含量增多,茶多酚含量減少。

茶多酚中主要成分為兒茶素類,包括表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)4種。曾亮等[18]研究發(fā)現(xiàn),兒茶素對革蘭氏陽性菌的抑制率比陰性菌高,效果更加明顯。熱穩(wěn)定性測定發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為25～80 ℃時,兒茶素的抑菌效果最好,且不受溫度的影響。兒茶素在酸性條件下比在堿性條件下穩(wěn)定。研究也證實,茶多酚可抑制或殺死金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌、百日咳桿菌、痢疾桿菌和霍亂弧菌等[19]。

研究表明,不同種類的細(xì)菌對多酚的耐受力不同,取決于多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)以及細(xì)菌種類。茶多酚的4種主要兒茶素物質(zhì)由于結(jié)構(gòu)不同,其抗菌活性也不盡相同,表現(xiàn)出的抗菌活性強弱順序為 EGCG>ECG>EGC>EC[20]。茶多酚一般為含有兩個以上互為鄰位的羥基多元酚,其基本結(jié)構(gòu)是C6-C3-C6碳架,酯型兒茶素較簡單兒茶素的抑菌效果更強,其分子結(jié)構(gòu)中比簡單兒茶索多結(jié)合1～2個沒食子?；?。其抑菌機理為茶多酚結(jié)構(gòu)中的酚羥基可與蛋白質(zhì)分子中的氨基或羧基結(jié)合,其疏水性的苯環(huán)結(jié)構(gòu)也可與蛋白質(zhì)發(fā)生疏水結(jié)合,茶多酚與蛋白質(zhì)之間的這種多點結(jié)合作用阻止了細(xì)菌的侵染,使其具有抑菌性?！H基團與菌體內(nèi)的二氫葉酸合成酶肽鍵上的氨基酸殘基結(jié)合,使二氫葉酸合成酶失活,影響細(xì)菌的核酸合成,進而使細(xì)菌的生長繁殖受到抑制[21]。

本研究結(jié)果表明,3種茶葉茶多酚提取物中,抑菌效果最強的為綠茶,之后為青茶,最后為黑茶,與華德興[22]的研究結(jié)果一致。茶葉中的主要抑菌成分為茶多酚,茶多酚含量的高低與抑菌作用的強弱有關(guān)。茶多酚也能夠促進細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性的發(fā)生,使其內(nèi)容物發(fā)生泄露,并且使細(xì)菌DNA及菌體蛋白發(fā)生一定程度的損傷。對于茶多酚中主要的化合物:EC、EGC、EGCG和ECG抑菌作用比較及機制的研究也是我們課題組今后關(guān)注的內(nèi)容。

4 結(jié)論

通過對西湖龍井、鐵觀音和普洱茶三種茶葉進行茶多酚的提取、抑菌活性比較以及細(xì)胞膜滲透性實驗,結(jié)果顯示，西湖龍井茶多酚提取物抑菌效果最優(yōu)。隨著茶多酚提取物濃度的增加,260 nm下的細(xì)菌滲透性物質(zhì)逐漸增多,并且基因組DNA的損傷程度逐漸增大,菌體蛋白質(zhì)發(fā)生一定程度的損傷,且在革蘭氏陽性菌中損傷更明顯。本實驗表明，不同種類茶葉中茶多酚含量與其抑菌效果有關(guān),為深入研究茶葉保健功能及抑菌機理研究提供了實驗依據(jù)。