水酶法提取大豆油工藝中乳狀液的酶法破乳研究

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(1.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院,廣西欽州 535011; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

水酶法是20世紀興起的一種環(huán)境友好的綠色制油技術(shù),它以水為提取介質(zhì),利用機械方式和酶破壞油料細胞壁,將油脂釋放出來,再利用油水密度差異,分離油和非油成分[1-2],具有無溶劑殘留、蛋白變性程度低、無污染等優(yōu)點[3-4],被廣泛應(yīng)用于多種作物提油工藝中,如大豆[5]、花生[6]、葵花籽[7]、菜籽[8]、玉米[9]、米糠[10]等。在水酶法水解過程中,蛋白質(zhì)、油、磷脂以及其他一些大分子物質(zhì),比如淀粉與纖維素等,同時釋放,這些物質(zhì)相互結(jié)合,將油脂包裹,形成穩(wěn)定的乳化體系[11],所以酶解離心后直接回收得到的游離油非常有限,大部分油都存在于油、水界面間的乳狀液中,因此破乳對水酶法技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用至關(guān)重要。目前常用的破乳方法有加熱法[12]、冷凍解凍法[13]、乙醇法[14]、生物酶法[15-16]、超聲聯(lián)合酶法[17]、調(diào)節(jié)pH法[18]。生物酶法是利用酶將乳狀液中包裹在油脂外圍的物質(zhì)分解,從而達到釋放油脂、回收游離油的目的[6],較于其他破乳方法,生物酶法具有反應(yīng)時間短、污染小、破乳率高的特點[13,15],但目前對于酶法破乳主要集中于工藝條件的優(yōu)化[16-17],而對破乳過程中乳狀液相關(guān)性質(zhì),如乳狀液粘度、電位、油滴粒徑分布等變化的系統(tǒng)研究較少,而這些性質(zhì)直接影響著乳狀液的穩(wěn)定性[18]。

本實驗針對乳狀液中的主要組成成分,分別采用α-淀粉酶、纖維素酶、Alcalase堿性蛋白酶、7L中性蛋白酶進行破乳,針對具有良好破乳效果的酶,動態(tài)考察其對破乳率及乳狀液性質(zhì)(粘度、Zeta電位、油滴粒徑分布和平均粒徑)的影響,為酶法破乳機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Alcalase堿性蛋白酶(1.2×105U/mL) 丹麥Novo公司;7L中性蛋白酶(1.5×105U/mL) 杰能生物科技集團;α-淀粉酶(3.7×103U/g) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;纖維素酶(1.5×104U/g) 美國Sigma公司;大豆 墾農(nóng)22號,含油率為22.3%,蛋白質(zhì)量分數(shù)為32.7%,貯存于4 ℃的冰箱中。

Master2000型激光粒度儀、ZEM 5003型Zeta電位儀 英國馬爾文公司;RS-150型流變儀 德國哈克公司;Z36HK型高速恒溫離心機 德國HERMLE Labortechnik GmbH公司;KDN-04Ш型蛋白質(zhì)測定儀 上海纖檢儀器有限公司;RT5-磁力攪拌器 德國IKA公司;BH-2研究級顯微鏡 日本奧林巴斯株式公社。

1.2 實驗方法

1.2.1 水酶法提取大豆油工藝中所形成乳狀液的制備 乳狀液的制備借鑒李楊等[19]的方法,其主要工藝流程為清理除雜的大豆經(jīng)粉碎后按含水率14%加水混合進行擠壓膨化,膨化條件為?？卓讖?8 mm,套筒溫度90 ℃,螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min,膨化大豆冷卻后粉碎并過80目篩,按料液比1∶6.5 g/mL加水混合,在pH9.5,55 ℃,2% Alcalase堿性蛋白酶(w/w,酶與豆粉質(zhì)量比)酶解3 h,所得酶解液升溫至90 ℃加熱10 min滅酶,4500 r/min離心20 min后,離心管中的物質(zhì)分為四相,從頂部到管底分別為游離油、乳狀液、水解液和不溶性殘渣,將乳狀液從離心管中分離出來,收集的乳狀液放置于4 ℃冰箱24 h,去除沉析出來的水分后,進行下面的實驗研究。

1.2.2 乳狀液中各組分含量的測定 蛋白含量的測定:依據(jù)GB 5009.5-2016中凱氏定氮法進行測定;乳狀液中油脂含量的測定:依據(jù)GB 5009.6-2016中的堿水解法測定;原料和殘渣中的油脂含量:依據(jù)GB 5009.6-2016索氏抽提法進行測定;水分的測定:依據(jù)GB/T 14489.1-2008;碳水化合物的測定:依據(jù)酸水解法測定[20];纖維素的測定:酸性洗滌劑法[20];磷脂含量的測定:采用GB/T 5537-2008中的重量法。

1.2.3 各種酶破乳方法的比較 將若干裝有15 g乳狀液的小燒杯置于不同溫度的水浴鍋中,分別添加α-淀粉酶、Alcalase堿性蛋白酶、7L中性蛋白酶、纖維素酶,酶與底物比均為0.6×105U/g,在各酶最適溫度及pH條件下酶解1 h后,3000 r/min離心15 min回收乳狀液中的游離油,同時設(shè)置各酶解條件下不加酶的空白樣實驗,以破乳率比較破乳效果。各酶的酶解條件如下:

淀粉酶:酶解溫度55 ℃,pH6.5;纖維素酶:酶解溫度37 ℃,pH5;堿性蛋白酶Alcalase:酶解溫度55 ℃,pH9;中性蛋白酶7L:酶解溫度55 ℃,pH7。

破乳率計算公式為:

1.2.4 酶添加量及酶解作用時間對破乳效果的影響 取若干份乳狀液置于55 ℃的水浴鍋中,7L中性和Alcalase堿性蛋白酶添加量分別為0.5%、1%、1.5%、2%(w/w)時,在各自適宜的pH條件下,分別測定酶解10、20、30、60、90、120 min時的破乳率。

當Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶濃度分別為0.5%和1%,酶解時間分別為0.5、1 h時,考察兩種酶對乳狀液粘度、粒徑分布、平均粒徑、電位值的影響。

1.2.5 乳狀液表觀粘度的測定 按Jung等[21]的方法并稍作修改,在室溫條件下,采用流變儀(模具60 mm)在剪切速率0.01～1 000 s-1范圍內(nèi)測定乳狀液的表觀粘度。

1.2.6 乳狀液中油珠粒徑分布及平均粒徑D4,3值的測定 參照Nikiforidis等[22]的方法,并作修改。將破乳后的乳狀液用去離子水稀釋至11%～14%濃度,室溫下用激光粒徑分析儀測定油珠粒徑分布,其中油滴的折光指數(shù)選擇1.47,驅(qū)散相折光指數(shù)為1.333,同時測定油珠平均粒徑D4,3值。

1.2.7 乳狀液電位的測定 參照Nikiforidis等[22]的方法,并作修改。將破乳后的乳狀液加入去離子水稀釋至0.01%濃度,充分混勻后,所得液體裝入測量皿,放入Zeta電位儀中測其電位。

1.2.8 乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)觀察 利用考馬斯亮藍對蛋白質(zhì)染色,蘇丹紅Ⅲ對脂肪球染色的原理,將少量蘇丹紅Ⅲ和0.2%考馬斯亮藍染液先后加入乳狀液中輕輕晃動混勻,在光鏡下觀察染色后的乳狀液微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 所有試驗數(shù)據(jù)均為3次平行測定結(jié)果,采用Statistix 8.1軟件進行顯著性分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳狀液的組成

表1顯示乳狀液的主要成分是油和水,而含量較少的蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素和磷脂組成了乳狀液中的連續(xù)相,維持著乳狀液的穩(wěn)定。

表1 乳狀液的主要成分Table 1 Main components of the emulsion

蛋白和磷脂是良好的乳化劑[23-24],可降低乳狀液中油水層間的界面張力,特別蛋白還可在液滴之間形成靜電阻礙,抑制油滴聚集[25]。淀粉和纖維素可與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起增加油水界面膜的有效吸附層厚度和界面粘滯力,抑制油滴聚合[24,26]。

Zhang等[23]已證實磷脂在室溫條件下濃度2%時可抑制油珠之間的聚合,由于磷脂在本乳狀液中含量較低,且磷脂酶價格較高,考慮到經(jīng)濟成本,本實驗不選用磷脂酶破乳,而是針對乳狀液中的淀粉、纖維素、蛋白質(zhì),選用α-淀粉酶、纖維素酶、Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶進行破乳。

2.2 各種酶的破乳效果

圖1顯示在所選酶中,破乳率最高的是Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶,然后依次是纖維素酶、α-淀粉酶。由于Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶對蛋白的水解作用,蛋白乳化性能下降,導(dǎo)致實現(xiàn)破乳,這說明蛋白是維持乳狀液穩(wěn)定的主要物質(zhì)。值得注意的是,盡管纖維素酶的破乳率較高,但是與其酶解條件下的空白樣相比破乳率并無顯著差異(p>0.05),說明纖維素酶的添加沒有顯著提高破乳率。多項研究結(jié)果已經(jīng)證明，當乳狀液處于較低pH時,特別是pH在蛋白等電點附近時,由于油體間電荷減弱導(dǎo)致蛋白凝集,乳狀液穩(wěn)定性顯著下降[13,18]。因此纖維素酶破乳的原因主要來自于酶解時較低的pH(酶解時pH為5)。相比于空白樣,盡管淀粉酶破乳效果明顯,但破乳率并不高,僅為67.2%,不能有效回收乳狀液中的游離油。因此選擇Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶進行下面的實驗。

圖1 各酶的破乳率Fig.1 Demulsification rate of the emulsion with the different enzymes treatment注:圖中不同字母代表數(shù)值間差異顯著(p<0.05)。

2.3 蛋白酶對破乳率的影響

圖2顯示相比于未添加酶的空白樣,Alcalase堿性蛋白酶的添加極大促進了乳狀液中油的釋放,增加了游離油回收率。且相同酶解時間內(nèi),Alcalase酶濃度的增加提高了破乳率,酶添加量越大,破乳率越高。酶解0～10 min內(nèi),酶解時間對破乳率影響極大,游離油得率隨酶解時間的增加明顯上升,此后隨酶解時間延長,各酶濃度條件下破乳率增加緩慢。本實驗中Alcalase堿性蛋白酶在0.5%、1%、1.5%、2%濃度時均可實現(xiàn)100%破乳率。

圖2 Alcalase堿性蛋白酶的破乳率Fig.2 Demulsification rate of the emulsion with alcalase protease treatment

圖3顯示添加7L中性蛋白酶同樣可以明顯提高破乳率。相似于Alcalase堿性蛋白酶破乳率的變化規(guī)律,酶解0～10 min時,破乳率隨酶解時間延長增加明顯,而酶解10 min后破乳率增加緩慢，酶解60 min后破乳率基本不變。但是,在酶添加濃度和酶解時間相同條件下,7L中性蛋白酶的破乳效果低于Alcalase堿性蛋白酶,這是由于Alcalase堿性蛋白酶對乳狀液中蛋白的水解能力強于7L中性蛋白酶[27],導(dǎo)致對乳狀液穩(wěn)定性的破壞程度強于7L中性蛋白酶,因此能更有效地將油脂從蛋白膜的包裹中釋放出來。本實驗中7L中性蛋白酶在添加濃度2%,酶解60 min時達到100%破乳。

圖3 7L中性蛋白酶的破乳率Fig.3 Demulsification rate of the emulsion with 7L neutral protease treatment

2.4 乳狀液的粘度

圖4、圖5顯示較與空白樣,Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶極大降低了乳狀液的粘度,且隨酶濃度的增加,水解時間的延長,乳狀液粘度相應(yīng)降低。由于蛋白酶將油水界面大分子蛋白水解生成小分子的肽,使吸附層不再緊密,導(dǎo)致乳狀液粘度降低[28]。粘度的降低意味著油滴運動所受粘滯阻力的減弱,油滴更易于聚合,因此Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶酶解后的乳狀液穩(wěn)定性下降,破乳率均高于未加酶的空白樣(見結(jié)果2.3)。

圖4 Alcalase堿性蛋白酶酶解后的乳狀液表觀粘度Fig.4 Apparent viscosity of emulsion after Alcalase protease treatment

圖5 7L中性蛋白酶酶解后的乳狀液表觀粘度Fig.5 Apparent viscosity of emulsion after 7L neutral protease treatment

相同酶濃度和水解時間內(nèi)經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶水解后的乳狀液粘度低于7L中性蛋白酶處理的乳狀液,即Alcalase堿性酶降低蛋白粘度的能力強于7L中性酶,這是Alcalase酶破乳率高于7L中性蛋白酶的原因之一。

無論是否添加蛋白酶,乳狀液在剪切速率0.01～100 s-1范圍內(nèi),均表現(xiàn)為剪切變稀,呈假塑性流體特性。但當剪切速率大于100 s-1時,乳狀液的粘度不再隨剪切速率的變化而有明顯變化,呈牛頓流體性質(zhì)。

2.5 乳狀液油珠粒徑分布和平均粒徑

圖6～圖7所示為Alcalase堿性蛋白酶破乳后的油珠粒徑分布與平均粒徑情況,經(jīng)Alcalase酶處理過的乳狀液油滴發(fā)生聚合,油珠粒徑增加顯著(p<0.05)。且隨Alcalase酶濃度和作用時間的增加,粒徑分布曲線相應(yīng)右移,平均粒徑不斷增大。

圖6 Alcalase堿性蛋白酶酶解后的乳狀液中油珠粒徑分布Fig.6 Particle size distribution profile of the emulsion after Alcalase protease treatment

圖7 Alcalase酶解作用后的乳狀液中油珠平均粒徑Fig.7 Mean droplet diameter of the emulsion after Alcalase protease treatment注:圖中不同字母表示數(shù)值間差異顯著(p<0.05)。

由于蛋白酶水解乳狀液中油水界面的蛋白,使蛋白鏈斷裂,界面膜不再緊密,從而使油滴從蛋白的包裹中釋放出來,促進了各油珠間的聚集和合并,導(dǎo)致油珠平均粒徑增大,并且隨酶添加量的增加,酶解時間的延長,油珠平均粒徑增加顯著(p<0.05),最終導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性降低,破乳率提高[6]。

與Alcalase堿性蛋白酶相似,添加7L中性蛋白酶的乳狀液,粒徑分布曲線右移,油珠平均粒徑增大,且隨7L蛋白酶濃度和酶解時間的延長,油滴聚集程度增強,平均粒徑增加顯著(p<0.05)(見圖8～圖9)。說明7L中性蛋白酶同樣具有促進乳中油滴聚合,降低乳狀液穩(wěn)定性的作用。

圖8 7L中性蛋白酶酶解后的乳狀液中油珠粒徑分布Fig.8 Particle size distribution profile of the emulsion after 7L neutral protease treatment

圖9 7L中性蛋白酶酶解后的乳中油珠平均粒徑Fig.9 Mean droplet diameter of the emulsion after 7L neutral protease treatment注:圖中不同字母表示數(shù)值間差異顯著(p<0.05),圖10、圖11同。

由于堿性蛋白酶水解蛋白的能力強于中性蛋白酶,因此盡管添加7L中性蛋白酶的乳狀液油珠平均粒徑明顯大于未加酶的空白樣,但在相同水解條件下,經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶處理的乳狀液油珠平均粒徑大于7L中性蛋白酶處理過的乳狀液,這與其破乳率變化趨勢一致。

2.6 乳狀液的電位

大豆乳狀液油-水界面兩邊通常存在電荷,具有雙電層與電位降,特別是起乳化作用的蛋白能夠解離,從而使界面電位更加明顯[29]。表面電位絕對值越大,各油體粒子間的排斥力越大,油體間越不易聚合,乳狀液越穩(wěn)定;表面電位絕對值越小,各油體粒子間排斥力越小,乳狀液越不穩(wěn)定。

添加Alcalase堿性蛋白酶或7L中性蛋白酶均可使乳狀液的電位下降(見圖10、圖11)。由于乳狀液中油水界面蛋白被酶水解,引起蛋白分子表面所帶電荷的變化,最終引起乳狀液電位值發(fā)生改變。無論Alcalase堿性酶還是7L中性蛋白酶處理的乳狀液,其電位均隨酶濃度的增加而降低;但在相同酶濃度下,隨酶解時間的延長,電位值變化差異不顯著(p>0.05)。

圖10 Alcalase酶作用后的乳狀液電位Fig.10 Zeta potential of the emulsion after alcalase treatment

圖11 7L中性蛋白酶酶解后的乳狀液電位Fig.11 Zeta potential of the emulsion after 7L neutral protease treatment

可見，Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶均能使乳狀液電位下降,油滴間靜電排斥力的減弱有益于油滴發(fā)生聚合,乳狀液穩(wěn)定性下降。

2.7 乳狀液的光鏡圖片

圖12a顯示，破乳前的乳狀液中油滴較小,且數(shù)量較多;酶解1 h時,相較于破乳前和未加酶的空白樣(圖b～圖c),添加Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶的乳狀液中油滴數(shù)量減少,油珠粒徑明顯增大(圖d～圖e),說明Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶的酶解有效促進了乳中油滴聚合,降低了乳狀液的穩(wěn)定性。

圖12 乳狀液光鏡照片F(xiàn)ig.12 Photo of the cream from enzyme-assistant aqueous extraction of soy oil注:P為包裹在油滴外圍的蛋白質(zhì);O為油滴;(a)破乳前的乳狀液40×;(b)空白樣pH9-55 ℃-1 h 40×; (c)空白樣pH7-55 ℃-1 h 40×;(d)0.5% Alcalse堿性蛋白酶酶解1 h 40×;(e)0.5% 7L中性蛋白酶解1 h 40×。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果顯示,Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶破乳效果優(yōu)于α-淀粉酶和纖維素酶。相同酶解條件下,Alcalase堿性蛋白酶的破乳率高于7L中性蛋白酶,Alcalase堿性蛋白酶在0.5%、1%、1.5%、2%濃度時,7L中性蛋白酶濃度在2%時均可實現(xiàn)徹底破乳。Alcalase堿性蛋白酶和7L中性蛋白酶破乳過程中降低了乳狀液的粘度和電位,導(dǎo)致油滴發(fā)生聚集,從而使乳狀液穩(wěn)定性下降,破乳率上升。