醬油釀造過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的形成與鑒定

,明達(dá), , ,成輝,,

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司,山東禹城 253000)

醬油是由大豆或豆粕等蛋白質(zhì)原料和面粉、小麥粉等淀粉質(zhì)原料,在曲霉等微生物產(chǎn)生的蛋白酶和淀粉酶等酶系作用下,經(jīng)過(guò)細(xì)菌、酵母菌等微生物的長(zhǎng)期發(fā)酵,形成的富有多種氨基酸和糖類(lèi)的色香味俱佳的調(diào)味品[1]。香氣是醬油風(fēng)味的重要品質(zhì)特征,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)醬油的揮發(fā)性香氣成分的檢測(cè)手段已經(jīng)十分成熟,熊芳媛等[2]通過(guò)用乙醚提取醬油香氣成分,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分離鑒定其化學(xué)組成;王林祥等[3]采用同時(shí)蒸餾萃取法提取某高鹽稀態(tài)醬油的揮發(fā)性成分,用GC/MS分析香氣成分,共鑒定出種52種化合物;還可以通過(guò)電子鼻對(duì)氣味進(jìn)行追蹤,但其識(shí)別精度不高。

頂空固相微萃取(HS-SPME)是一種集萃取、濃縮樣品中揮發(fā)性香氣成分的技術(shù),具有操作簡(jiǎn)便、快速,無(wú)需溶劑等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于諸如酒類(lèi)、豆瓣醬和豆豉等發(fā)酵產(chǎn)品的揮發(fā)性香氣成分的檢測(cè)。目前通過(guò)頂空固相微萃取的方法分析醬油中的香氣成分的研究較為普遍:Meng等[4]在日式醬油中首次運(yùn)用頂空固相微萃取鑒別出3種揮發(fā)性硫醇——糠基硫醇(咖啡香)、芐基硫醇(煙熏焦臭味)和2-巰基丙酸乙酯(熱帶果香)并證明這三種物質(zhì)是熱殺菌醬油中的典型香氣物質(zhì)。張艷芳等[5]利用固相微萃取的方法從低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油中分析鑒定出55 種揮發(fā)性風(fēng)味成分,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4-乙基愈創(chuàng)木酚低鹽固態(tài)醬油特有的重要香氣成分;Sun等[6]采用SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)12種高鹽稀態(tài)法發(fā)酵的商業(yè)醬油中80種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其共有香氣組分有34種,而主要香氣成分是醇類(lèi)和酸類(lèi);張海珍等[7]人研究發(fā)現(xiàn)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中含有76種香氣組分,而低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油中含有62種香氣組分。綜上,可以發(fā)現(xiàn)低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油由于發(fā)酵周期短,其香氣組分明顯少于高鹽稀態(tài)發(fā)酵的醬油。而基于醬油質(zhì)量和產(chǎn)率的考慮,工廠中通常在低鹽固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上適當(dāng)提高鹽含量,避免了較長(zhǎng)的發(fā)酵周期,能夠明顯提高釀造醬油的風(fēng)味,但對(duì)這種釀造工藝的研究未有報(bào)道。

本研究是通過(guò)運(yùn)用頂空固相微萃取的方法對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間段的醬油香氣成分進(jìn)行分析,以期對(duì)醬油的香氣形成進(jìn)行探究,并為提升傳統(tǒng)醬油的品質(zhì)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬油樣品 取自珍選公司。

2010-plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司;手動(dòng)進(jìn)樣器、固相微萃取頭(75 μm CAR/PDMS) Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 醬油的發(fā)酵工藝流程圖

圖1 醬油發(fā)酵工藝流程圖Fig.1 Soy sauce fermentation process

1.2.2 醬油樣品的采樣 從黑龍江省珍選公司發(fā)酵車(chē)間分別取發(fā)酵第5、10、20、30、42、50、59 d的醬油進(jìn)行采樣,每個(gè)樣品(大約200 mL)封裝在不透明的塑料瓶中,并立即保存于-4 ℃冰箱中,以備分析。

1.2.3 萃取條件 參考鄧岳等[8]的方法,吸取醬油5 mL放入15 mL頂空進(jìn)樣瓶中,加入磁力攪拌子,放在40 ℃水浴鍋中保持20 min,磁力攪拌速度200 r/min。用75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭的手動(dòng)進(jìn)樣器對(duì)醬油樣品萃取,萃取溫度40 ℃,頂空吸附40 min。

1.2.4 揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS測(cè)定 采用TR-5ms彈性石英毛細(xì)色譜分析柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣為高純氦氣(1.0 mL/min),采用電子轟擊電離(EI)離子源,電子能量70 eV,電子倍增器電壓350 V,離子掃描范圍33～350 m/z,掃描速度3.00 scans/s,離子源溫度250 ℃,傳輸線(xiàn)溫度250 ℃。程序升溫條件(液體進(jìn)樣):起始溫度60 ℃,保持2 min,以10 ℃/min 升至90 ℃,保持2 min,再以5 ℃/min升至130 ℃,保持2 min,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持3 min。進(jìn)樣量5 μL,不分流[9]。

通過(guò)計(jì)算機(jī)檢索,同時(shí)利用NIST 08和WILEY 09譜庫(kù)相互匹配進(jìn)行定性分析。各組分相對(duì)含量按照峰面積歸一化法計(jì)算。

1.2.5 香氣活性值(OAVs) 香氣活性值(odor active values,OAVs)用于表征香氣成分的貢獻(xiàn)度[10],計(jì)算公式如下:

式中,A:某揮發(fā)性成分的質(zhì)量濃度,μg/L;B:該揮發(fā)性成分的閾值,μg/L。

1.2.6 主成分分析 選取樣品中香氣活性值大于1的揮發(fā)性香氣成分作為主要成分,進(jìn)行主成分分析。從這些主要呈香物質(zhì)中提取出兩個(gè)主要成分,其累計(jì)貢獻(xiàn)率為100%,完全能代表呈香物質(zhì)的絕大部分信息[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)三次,檢測(cè)結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用SPSS 20.0 軟件的Duncan 多重檢驗(yàn)及主成分分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析[12],圖表制作采用Origin 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油HS-SPME氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖

通過(guò)運(yùn)用頂空固相微萃取的方法對(duì)發(fā)酵時(shí)間分別為第5、10、20、30、42、50、59 d的醬油樣品進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果如圖2所示,可以看出醬油中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)得到了很好的分離。總揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量見(jiàn)表1，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,共統(tǒng)計(jì)了31種風(fēng)味化合物,其中包括醇類(lèi)3種,酸類(lèi)4種,醛類(lèi)4種,酯類(lèi)6種,酚類(lèi)4種,呋喃3種,其他化合物7種。醇類(lèi)物質(zhì)為:1-辛烯-3-醇、苯乙醇、1,5-甲基-2-(1-甲基乙基)環(huán)己醇;酸類(lèi)物質(zhì)為:乙酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸;醛類(lèi)主要成分為:苯乙醛、壬醛、苯甲醛;酯類(lèi)的主要成分為:1,2-苯二甲酸二異丁酯、苯乙酸乙酯;酚類(lèi)為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木酚。

圖2 醬油HS-SPME氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of soy sauce HS-SPME gas chromatography-mass spectrometry

表1 總揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量Table 1 Relative content of total volatile substances

通過(guò)對(duì)頂空固相微萃取所得到的香氣成分的含量和香氣活性值進(jìn)行分類(lèi)整理(表1)可以發(fā)現(xiàn):在醬油發(fā)酵過(guò)程中,除了醛類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)在發(fā)酵42 d后種類(lèi)稍有減少,其他各類(lèi)化合物種類(lèi)總體保持增長(zhǎng)的趨勢(shì)。在發(fā)酵前期,各類(lèi)化合物的含量均呈現(xiàn)升高趨勢(shì),到第42 d時(shí),醇類(lèi)、酯類(lèi)、酚類(lèi)的含量達(dá)到最大值,而在發(fā)酵后期,醇類(lèi)、酸類(lèi)、醛類(lèi)、酚類(lèi)則表現(xiàn)出下降的趨勢(shì),這可能是由于部分物質(zhì)性質(zhì)活潑,與其他物質(zhì)結(jié)合生成新組分;呋喃類(lèi)和其他類(lèi)則保持持續(xù)增長(zhǎng)。

香氣活性值是用于表征醬油重要呈味物質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。通常認(rèn)為OAVs 大于1 的化合物對(duì)醬油的風(fēng)味有貢獻(xiàn)。由表1可知,香氣活性值>1的化合物共有4種,包括1-辛烯-3-醇,苯乙醛,乙酸,4-乙烯基愈創(chuàng)木酚,香氣活性值<1的化合物有8種,對(duì)香氣的形成也有一定的貢獻(xiàn)。

醬油中的醇類(lèi)物質(zhì)主要是由糖和氨基酸的微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)生的,實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的主要的醇類(lèi)化合物包括1-辛烯-3-醇、苯乙醇、5-甲基-2-(1-甲基乙基)環(huán)己醇,其他的醇類(lèi)化合物由于匹配值<80%而被忽略。在這三種化合物中,1-辛烯-3-醇和苯乙醇含量較高,并且1-辛烯-3-醇的平均香氣活性值達(dá)到4.6。1-辛烯-3-醇是米曲霉孢子的特征性揮發(fā)性成分,帶有一種蘑菇的香氣[16],而醬油的發(fā)酵過(guò)程中采用了米曲霉作為主要的發(fā)酵菌種,可以推測(cè) 1-辛烯-3-醇可能主要來(lái)源于大曲發(fā)酵階段。苯乙醇具有玫瑰的香氣,是酵母菌乙醇發(fā)酵降解苯丙氨酸的產(chǎn)物[17],在本次實(shí)驗(yàn)中并未檢測(cè)到乙醇,原因可能是大部分的乙醇均被降解為苯乙醇[18]。

醬油中檢測(cè)到的酸類(lèi)物質(zhì)有4種,分別為乙酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸,在醬油生產(chǎn)過(guò)程中,乙酸是全部樣品中均檢出的物質(zhì),主要是由乳酸菌等繁衍代謝產(chǎn)生的,平均香氣活性值為2,對(duì)醬油香氣的貢獻(xiàn)很大,在很多發(fā)酵工藝中會(huì)通過(guò)添加酵母菌改善醬油風(fēng)味[19-20]。而2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸均具有“奶酪香”的香氣特征。

醬油中醛、酮類(lèi)物質(zhì)一般具有令人愉悅的香味,如甜香、草香、果香、焦香等,因此被認(rèn)為是可以提高食品風(fēng)味質(zhì)量的物質(zhì)。醬油中檢出的化合物以苯乙醛、壬醛、苯甲醛為主,且在所有醬油中均有檢出。苯乙醛的平均香氣活性值是1.5,具有濃郁的玉簪花香氣,是釀造醬油中的特征組分。這3個(gè)醛類(lèi)能夠由氨基酸降解產(chǎn)生,因此其產(chǎn)生可能與發(fā)酵過(guò)程蛋白質(zhì)代謝有關(guān)系[21]。

醬油中酯類(lèi)化合物是已報(bào)道物質(zhì)中品種最多的。大部分酯類(lèi)物質(zhì)來(lái)源于發(fā)酵過(guò)程中醇與脂肪酸的酯化反應(yīng),在本次試驗(yàn)中酯類(lèi)化合物僅檢出6種——苯乙酸乙酯、軟脂酸乙酯、鄰苯二甲酸異丁酯、1,2-苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸異丁酯、2-甲基-丙酸 1-叔丁基-2-甲基-1,3-丙烷二基酯,這些組分是發(fā)酵過(guò)程的耐鹽酵母的主要代謝產(chǎn)物,賦予其悅?cè)说摹八恪?、“酯香”等[22]。

酚類(lèi)和吡嗪類(lèi)化合物是發(fā)酵豆制品中非常重要的化合物。本研究檢測(cè)出的4種酚類(lèi)物質(zhì)都是醬油中常見(jiàn)的風(fēng)味化合物,能貢獻(xiàn)煙熏香氣,其中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在所有樣品中均檢出,并且含量相對(duì)較高,平均香氣活性值達(dá)到3.4。這些酚類(lèi)物質(zhì)常被認(rèn)為與木質(zhì)素的代謝有關(guān),有研究表明增加原料中小麥粉的比例能夠提高該類(lèi)物質(zhì)的含量[23]。在很多研究中酚類(lèi)物質(zhì)被認(rèn)為是醬油醬香味的主要來(lái)源,雖然它們的含量不高,但是由于閾值較低,所以它們具有相對(duì)較高的氣味活度值,因此對(duì)于醬油濃郁的醬香味等風(fēng)格特征具有決定性的作用[24],而吡嗪類(lèi)化合物因?yàn)槠ヅ涠刃∮?0%,未在本次實(shí)驗(yàn)中未檢出。

呋喃化合物僅檢出3種,分別為3-苯基-呋喃、2-乙烯基-苯并呋喃2,5-二甲基-呋喃。然而曾經(jīng)被報(bào)道的重要呋喃類(lèi)化合物如4-羥基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮(HEMF)和4-羥基-2,5-二甲基-3-呋喃酮(HDMF)并未在此次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出,這可能與分析方法采用SPME有關(guān)系[25]。其他類(lèi)物質(zhì)較多,但其氣味閾值尚未找到,其對(duì)香氣的貢獻(xiàn)度還有待研究。

2.2 重要香氣成分的主成分分析

對(duì)4種主要的香氣成分1-辛烯-3-醇,苯乙醛,乙酸,4-乙烯基愈創(chuàng)木酚進(jìn)行主成分分析,得到了圖3中的主成分分析的得分圖和載荷圖。主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)百分比為分別為57.824%和26.977%,根據(jù)得分圖,可以將不同發(fā)酵時(shí)間段的醬油樣品分為3簇,第一簇為第5、10、20 d的樣品,第二簇為第30 d的樣品,第三簇為第42、50、59 d的樣品。發(fā)酵前20 d,香氣成分緩慢積累,到第30 d時(shí),出現(xiàn)較大的增長(zhǎng),而到發(fā)酵第42 d時(shí),香氣成分的種類(lèi)和含量都幾乎達(dá)到最大值,與發(fā)酵第50 d、第59 d的差別不大。根據(jù)載荷圖,對(duì)4種主要的香氣成分1-辛烯-3-醇,苯乙醛,乙酸,4-乙烯基愈創(chuàng)木酚進(jìn)行主成分分析,從這4種主要呈香物質(zhì)中提取出兩個(gè)主要成分,其累計(jì)貢獻(xiàn)率為84.801%,能代表呈香物質(zhì)的絕大部分信息,發(fā)酵時(shí)間為 5、10、20、30 d的點(diǎn)落在第1象限,主要以具蘑菇香風(fēng)味的1-辛烯-3-醇,乙酸及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚為特征;發(fā)酵時(shí)間為 42、50、59 d的點(diǎn)落在第2 象限,與具玉簪花香氣的苯乙醛相對(duì)應(yīng)。綜上,發(fā)酵時(shí)間為5～42 d時(shí),主要以1-辛烯-3-醇,乙酸及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚為特征組分,而發(fā)酵時(shí)間為42～59 d時(shí),主要以苯乙醛為特征組分。

圖3 主成分分析的得分圖(A)和載荷圖(B)Fig.3 Score map(A)and load map(b)of the principal component analysis

3 結(jié)論

通過(guò)運(yùn)用頂空固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)的方法測(cè)定了珍選醬油釀造過(guò)程中多種揮發(fā)性香氣成分,研究發(fā)現(xiàn):這個(gè)發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)出31種揮發(fā)性的香氣化合物,包括醇類(lèi)3種,醛類(lèi)4種,酸類(lèi)4種,酯類(lèi)6種,酚類(lèi)4種,呋喃3種,其他化合物7種。醛類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)的種類(lèi)和含量在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì),在發(fā)酵第42 d達(dá)到最大值,其他各類(lèi)化合物種類(lèi)則總體保持增長(zhǎng)的趨勢(shì)。通過(guò)測(cè)定其香氣活性值,確定了珍選醬油中主要的香氣物質(zhì)為1-辛烯-3-醇、苯乙醛、乙酸、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚;在主成分分析中,發(fā)酵時(shí)間為5～42 d時(shí),主要以1-辛烯-3-醇,乙酸及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚為特征組分,而發(fā)酵時(shí)間為42～59 d時(shí),主要以苯乙醛為特征組分。本文通過(guò)對(duì)珍選醬油釀造過(guò)程中揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析,不僅揭示了香氣成分的形成與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系,而且為快速提升傳統(tǒng)醬油的品質(zhì)提供理論依據(jù),具有實(shí)踐意義。