超高壓耦合酶解鱈魚骨的工藝優(yōu)化 及其對酶解液滋味的影響

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(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工 及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.榮成泰祥食品股份有限公司,山東威海 264300)

狹鱈魚(Pollock,Theragrachalcogramma)俗稱明太魚或朝鮮明太魚,屬脊椎動物門(Vertebrata)鱈形目(Gadiformes)[1],是重要的經(jīng)濟魚類,廣泛分布于太平洋北部。鱈魚作為我國遠洋捕撈的重要魚種之一,年加工量可達50萬噸[2]。鱈魚骨是鱈魚加工過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物之一,骨間仍殘留大量的魚肉,約占魚體總重的15%[3]。傳統(tǒng)的處理方法是加工成魚粉或動物飼料,目前國內(nèi)關(guān)于鱈魚下腳料的加工主要為集中利用雙酶復(fù)合水解制取魚蛋白、水解制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和酶解制備明膠多肽螯合鈣等[4-6],但上述方法均存在酶解效率低下、酶耗量較高的問題。

超高壓技術(shù)是一種通過給蛋白質(zhì)體系提供一定的壓力,改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),從而提高蛋白質(zhì)原本生物學功能的物理改性方法[7-8]。超高壓能使蛋白質(zhì)適當變性利于酶解[9-10],另有研究表明,超高壓還會改善酶解液的風味[11]。本文以鱈魚加工副產(chǎn)物鱈魚骨為研究對象,采用超高壓耦合酶解技術(shù),通過單因素實驗和正交試驗優(yōu)化鱈魚骨高壓酶解工藝,以期通過超高壓耦合處理提高酶解效率,改善酶解效果,旨在為超高壓耦合酶解技術(shù)在水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中的應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱈魚骨 大連天寶綠色食品股份有限公司;堿性蛋白酶(2.4 AU-A/g)、風味蛋白酶(500 LAPU/g) 丹麥Novozymes公司;福林酚、三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)、甲醛、標準氫氧化鈉溶液(0.05 mol/L) 分析純,北京市索萊寶科技有限公司;酪氨酸標準品 北京市索萊寶科技有限公司。

HPP.L2-600/0.6型超高壓設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司;LY-380D隆粵商用多功能破壁料理機 中山市隆粵電器廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;Biofuge stratos臺式冷凍高速離心機 美國Thermo Fisher公司;Orion Star系列手持式便攜pH計 美國Orion公司;Thermo公司全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鱈魚骨的酶解工藝流程 參考Hou等[2]的方法,鱈魚骨解凍、清洗后加水粉碎,至沒有明顯大顆粒(粒徑<0.5 cm),取300 g進行試驗,料水質(zhì)量比1∶1,調(diào)節(jié)pH,加入0.3%魚骨質(zhì)量的堿性蛋白酶和0.1%魚骨質(zhì)量的風味蛋白酶,55 ℃常壓酶解3 h或在一定超高壓下條件下酶解一定時間后,轉(zhuǎn)入常壓酶解至3 h,95 ℃滅酶15 min過濾(200目濾網(wǎng)),3500 r/min離心20 min,取上清液分裝于蒸煮袋中,于-80 ℃條件下冷凍以備檢測。

1.2.2 單因素實驗 取5份粉碎后的鱈魚骨(每份300 g),參照上述酶解工藝,選取酶解壓力、酶解時間、酶解pH這三個因素進行單因素實驗,以氨基酸態(tài)氮含量作為酶解液的評價指標。

1.2.2.1 壓力對酶解效果的影響 壓力分別設(shè)為50、100、150、200、250 MPa,其它固定條件為:pH7.5,超高壓時間60 min,料水比1∶1,酶解溫度55 ℃。

1.2.2.2 酶解時間對酶解效果的影響 酶解時間分別設(shè)為20、40、60、80、100 min,其它恒定條件為:pH7.5,壓力100 MPa,料水比1∶1,酶解溫度55 ℃。

1.2.2.3 pH對酶解效果的影響 分別調(diào)節(jié)pH至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,其它恒定條件為:壓力100 MPa,酶解時間60 min,料水比1∶1,酶解溫度55 ℃。

1.2.3 正交試驗 基于單因素實驗結(jié)果,以酶解液中的氨基酸態(tài)氮含量為指標,選擇酶解壓力、酶解時間、酶解pH三個因素,進行L9(34)正交試驗,確定超高壓耦合酶解鱈魚骨的最佳工藝條件,因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 可溶性肽含量的測定 標準曲線的繪制:配制濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/mL的酪氨酸溶液,分別取1 mL(做三個平行)于不同的試管中,加入5 mL福林酚試劑甲,混勻后在20～25 ℃下放置10 min,再加入0.5 mL福林酚試劑乙,立即搖勻,在20～25 ℃保溫30 min,然后在波長500 nm處測定光密度值,取三組測定的平均值,吸光度為橫坐標,以可溶性肽濃度為縱坐標,繪制標準曲線。

樣品測定:采用TCA沉淀法對樣品進行前處理。具體操作為:將3 mL的樣液加入至27 mL質(zhì)量分數(shù)為5%的TCA,均質(zhì)后于4 ℃下放置1 h,5 000 r/min離心10 min,得上清液。然后用超純水稀釋至合適濃度使可溶性肽的濃度控制在0.2～0.25 μg/mL范圍之內(nèi)。取1 mL稀釋液加入5 mL福林酚試劑甲混勻后在20～25 ℃下放置10 min,再加入0.5 mL福林酚試劑乙,立即搖勻,在20～25 ℃保溫30 min,然后在波長500 nm處測定光密度值?？瞻讓φ?另取3 mL純水加入至27 mL質(zhì)量分數(shù)為5%的TCA,以下操作同樣品測定。

1.2.5 氨基酸態(tài)氮和氨基酸含量的測定 參考姜紹通等[12]的方法,采用甲醛滴定法對酶解液進行氨基酸態(tài)氮含量的測定。

氨基酸含量采用氨基酸自動分析儀進行測定。分別統(tǒng)計總游離氨基酸(total free amino acids,TFAA)、必需氨基酸(essential amino acids,EAA)、非必需氨基酸(nonessential amino acids,NEAA)和呈味氨基酸(delicious amino acids,DAA)的含量。DAA及TAV分析:滋味有酸、甜、苦、咸和鮮5種基本味覺,DAA含量對呈味起著至關(guān)重要的作用。TAV表示各個呈味物質(zhì)的含量與其閾值的比,當TAV大于1時,認為該物質(zhì)對呈味有貢獻,而TAV小于1時認為該物質(zhì)對呈味沒有貢獻[13],由此可以確定主要呈味的氨基酸。

1.2.6 感官評價 感官評定小組由10人(5男5女)經(jīng)專業(yè)培訓后組成,對酶解液進行描述性感官鑒評,描述統(tǒng)計其風味,具體評價標準見表2[14]。

表2 酶解液感官評價標準Table 2 Evaluation criteria of sensory of hydrolysates

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)3次,結(jié)果以“Mean±SD”表示,采用SPSS 19.0(美國IBM公司)統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和方差分析,采用多重比較分析法對各處理組進行顯著性分析,p<0.05為差異顯著,p<0.01為差異極顯著。采用Origin Pro 9.1(美國OriginLab公司)進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 壓力對酶解液氨基酸態(tài)氮的影響 由圖1可知,超高壓壓力由50 MPa增加到250 MPa的過程中,氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,不同壓力條件下(100～200 MPa)氨基酸態(tài)氮含量的變化差異極顯著(p<0.01)。在超高壓壓力為100 MPa時,氨基酸態(tài)氮含量達到最高,為0.360 g/100 mL。較低的壓力對酶活中心具有凝聚作用,在50 MPa加壓到100 MPa過程中,酶的活性中心逐漸被激活。Maria等[15]亦研究發(fā)現(xiàn),隨著壓力增大,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展,水解度增加;而當壓力超過400 MPa時,蛋白質(zhì)發(fā)生聚集,水解度下降。在本研究中,壓力超過100 MPa后,氨基酸含量發(fā)生下降,這可能是超高壓作用使酶的活性中心的氨基酸組成發(fā)生改變或逐漸喪失活性中心,從而改變酶的催化活性,使水解度下降[16]。因此,選擇100 MPa為最適超高壓壓力。

圖1 壓力對酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effect of pressure on the content of amino-acid nitrogen in hydrolysates注:不同字母代表差異極顯著(p<0.01),圖2～圖3同。

2.1.2 酶解時間對酶解液氨基酸態(tài)氮的影響 由圖2可知,酶解時間從20 min增加到100 min的過程中,氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,不同時間條件下氨基酸態(tài)氮含量的變化差異極顯著(p<0.01)。酶解時間過短,會使酶活性中心激活不完全,在酶解時間增加至60 min過程中,隨著酶活性中心逐漸被激活,氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加,至60 min氨基酸態(tài)氮含量達到最大值,為0.372 g/100 mL。謝丹丹等[17]研究發(fā)現(xiàn),200 MPa條件下,隨著酶解時間的延長,木瓜蛋白酶的活性先增加后降低,隨著酶解時間的繼續(xù)增加,長時間的超高壓處理導致酶活降低,從而使得酶解效率降低。因此,本研究選擇60 min為最適酶解時間。

圖2 酶解時間對酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of enzymolysistime on amino-acid nitrogen of hydrolysates

2.1.3 pH對酶解液氨基酸態(tài)氮的影響 大部分酶制劑對pH較敏感,pH能夠影響酶分子活性部位有關(guān)基團和底物的解離,使底物不適于與酶結(jié)合或兩者的結(jié)合力降低,從而影響酶解反應(yīng)的速度。由圖3可知,超高壓酶解在pH從6.5增加到8.5的過程中,氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,不同酶解pH條件下氨基酸態(tài)氮含量的變化差異極顯著(p<0.01)。在pH為8時,氨基酸態(tài)氮含量達到最大值,為0.378 g/100 mL。因此選擇最適pH為8。

圖3 pH對酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of pH on amino-acid nitrogen of hydrolysates

2.2 正交試驗結(jié)果

超高壓耦合酶解鱈魚骨的正交試驗結(jié)果見表3。由表3可知,影響超高壓耦合酶解效果的因素主次順序依次為:B>C>A,即酶解時間>pH>壓力。比較均值k大小可以得出超高壓耦合酶解鱈魚骨的最佳組合A3B2C2,即壓力150 MPa、酶解時間60 min、pH7.5。在最優(yōu)條件下進行3次驗證試驗,測得氨基酸態(tài)氮的含量達到(0.380±0.04)g/100 mL,優(yōu)于各個正交試驗組,而常壓酶解所得的酶解液中氨基酸態(tài)氮的含量是0.226 g/100 mL,超高壓酶解液中的氨基酸態(tài)氮含量是常壓酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的1.68倍,說明超高壓處理作為一種輔助酶解的手段,有效提高了酶解液中的氨基酸態(tài)氮含量,促進了酶解效率。

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal test

表4為正交試驗方差分析,由表4可知,以氨基酸態(tài)氮含量為指標影響超高壓耦合酶解的主次順序為酶解時間>pH>壓力,方差分析和極差分析結(jié)果一致。

表4 正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test

2.3 超高壓耦合酶解鱈魚骨酶解液的感官評價結(jié)果

對最優(yōu)組合超高壓耦合酶解液和常壓酶解液的感官進行評價,如圖4所示。超高壓耦合酶解液的腥味、苦味和澀味均弱于常壓酶解液,鮮味強于常壓酶解液,說明超高壓耦合酶解處理改善了酶解液的風味。

圖4 酶解液感官評價雷達圖Fig.4 Radar map of enzymatic hydrolysis sensory evaluation

2.4 超高壓耦合酶解鱈魚骨酶解液中可溶性肽的含量

肽是由蛋白質(zhì)大分子降解得到的,因此,酶解液中可溶性肽含量的高低反映了酶解效率的大小。從營養(yǎng)學角度來說,肽類比同一氨基酸組成蛋白質(zhì)的消化吸收率要高,且風味優(yōu)于單個氨基酸,有的肽還具有特征性的滋味,且不易導致過敏現(xiàn)象。超高壓耦合酶解液和常壓酶解液中的可溶性肽含量如圖5所示。由圖5可知,超高壓耦合酶解液中可溶性肽的含量顯著(p<0.05)大于常壓酶解,是常壓酶解液中可溶性肽含量的1.47倍,該結(jié)果和邵懿等[18]的研究結(jié)果一致。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是由肽鏈內(nèi)和肽鏈間的氫鍵來維持,而超高壓的作用有利于氫鍵的形成。因此,超高壓處理有利于二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,但會破壞其三四級結(jié)構(gòu),其疏水及離子結(jié)合會因體積的縮小而被切斷,導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展,暴露出更多的催化活性位點,所以超高壓處理酶解液中的多肽含量高于常壓酶解。

圖5 酶解液可溶性肽含量Fig.5 Soluble peptide of hydrolysates注:不同字母代表差異顯著(p<0.05)。

2.5 超高壓耦合酶解鱈魚骨酶解液的游離氨基酸組成及含量

由表5可以看出,常壓酶解液中TFAA含量為(5539.1±7.6) mg/100 mL,而超高壓耦合酶解液中TFAA含量為(6240.4±8.1) mg/100 mL,為常壓酶解液的1.13倍,該結(jié)果與Yoshino等[21]的研究一致,該研究團隊發(fā)現(xiàn),相同酶解條件下魚肉經(jīng)100 MPa超高壓處理酶解后游離氨基酸含量普遍高于常壓(0.1 MPa)酶解。超高壓處理使得酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,致使更多的活性位點暴露,激活了酶的催化效應(yīng),產(chǎn)生了更多的游離氨基酸,因此適當壓力條件下,超高壓耦合酶解對酶解效果有促進作用,該實驗結(jié)果與Northrop[22]和勵建榮[10]等報道的結(jié)論一致。

表5 酶解液游離氨基酸組成、呈味特性及TAV值Table 5 Free amino acid composition,flavor characteristics and TAV of hydrolysates

常壓酶解液和超高壓耦合酶解液中均含有17種游離氨基酸,其中以谷氨酸含量最高(分別占TFAA含量的14.27%和14.60%),其次為脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、亮氨酸、天門冬氨酸。常壓酶解液和中超高壓耦合酶解液EAA占TFAA含量的分別為32.68%和33.38%,DAA占TFAA的含量分別為97.81%和98.02%。由此可見,超高壓耦合酶解具有提高酶解產(chǎn)物中的必需氨基酸和呈味氨基酸含量的趨勢。游離氨基酸分鮮、甜和苦3類[23],表5中苦味氨基酸9種,鮮味2種,甜味5種。DAA的TAV值越大,呈味作用越顯著,對滋味的貢獻越大[24]。常壓酶解液和超高壓耦合酶解液中,除蘇氨酸外的每種DAA的TAV均大于1,對樣品整體滋味的形成具有一定的貢獻。谷氨酸鮮味最強,是重要的鮮味劑,其在常壓酶解液和超高壓耦合酶解液中TAV最大,分別為26.3和30.4,對滋味的貢獻度最大。甜味氨基酸和鮮味氨基酸作為良好呈味基料的基礎(chǔ),可以呈現(xiàn)良好的滋味[25,26]。此外,TAV較高的還有組氨酸、賴氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、甘氨酸、精氨酸、天門冬氨酸,其中天門冬氨酸為鮮味氨基酸,丙氨酸、甘氨酸為甜味氨基酸,其余6種為呈苦味氨基酸。由此可見,在超高壓耦合酶解下,谷氨酸的TAV值增長明顯,對酶解液的滋味具有更大貢獻。

3 結(jié)論

本研究采用超高壓耦合酶解技術(shù),通過單因素實驗和正交試驗優(yōu)化鱈魚骨高壓酶解工藝,探討了超高壓耦合酶解對酶解液的氨基酸態(tài)氮、感官評價、可溶性肽、游離氨基酸等指標的影響。結(jié)果表明,在pH7.5、150 MPa條件下加壓處理60 min的最優(yōu)條件下,氨基酸態(tài)氮的含量達到(0.380±0.04) g/100 mL,提高了1.68倍;感官評價表明,超高壓耦合降低了酶解液的腥味、苦味和澀味,增強了酶解液的鮮味,酶解液風味得到改善;可溶性肽含量提高了1.47倍;游離氨基酸總量達到(6240.4±8.1) mg/100 mL,是常壓酶解液的1.13倍;谷氨酸的TVA值最大,對酶解液的滋味貢獻最大。超高壓耦合酶解提高了鱈魚骨的酶解效率,改善了酶解產(chǎn)物風味,具有提高酶解產(chǎn)物中的必須氨基酸和呈味氨基酸含量的趨勢。本研究為超高壓耦合酶解技術(shù)在水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。