南美白對蝦蝦頭制備鮮味水解物的研究

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(1.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530000; 2.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510545)

南美白對蝦是三大優(yōu)良對蝦品種之一。其肉質鮮美且營養(yǎng)價值高,因此深受消費者喜愛,在全球市場上具有較高需求量。2015年亞洲區(qū)對蝦產(chǎn)量占全球產(chǎn)量的46%,其中中國的對蝦貿易額占據(jù)了全球水產(chǎn)市場的15%[1-3]。我國對蝦主要以去頭凍蝦仁形式出口,導致產(chǎn)生超過約50多萬噸的蝦頭廢棄物[3-5]。研究表明南美白對蝦蝦頭(干基)中存在60.3%蛋白質、19.9%灰分和7.9%脂肪、11%甲殼素,同時還含有鉀、鈣、鈉、鎂、鋅等常量和微量礦物質[6-7]。因此,蝦頭廢棄不僅造成嚴重的環(huán)境污染,更是一種資源的浪費。目前已有科研工作者從蝦頭中提取甲殼素[8-9]、蛋白質[10-11]和蝦青素[12]等物質。蝦頭中的蛋白質含量高,氨基酸種類齊全,更有高含量的鮮味氨基酸和甜味氨基酸,所以有不少科研工作者利用蝦頭制備水解物,再進一步加工為調味品[13]。

將蝦頭應用于調味品開發(fā)中,其滋味是重要評價指標。傳統(tǒng)的 “感官鑒評”法，主觀意識干擾較多,高效液相(HPLC)等精密儀器的化學分析方法無法涵蓋食物中所有的滋味物質,而TS-5000Z電子舌是與人體味覺感官評價相吻合的味覺分析系統(tǒng),能夠表述出傳統(tǒng)的化學儀器不能測量的參數(shù),對滋味的全面分析和人體感覺高度相關且具有良好的重現(xiàn)性、低檢測限和高靈敏度,更具有客觀性。Hayashi等[14-15]已使用電子舌針對綠茶的澀味和苦味建立了有效可靠的評價體系;舒靜等[16]通過研究發(fā)現(xiàn)，電子舌能夠很好地辨別不同地域、不同品牌的食醋,直觀地反映各品牌之間的味感差異。因此,將電子舌與感官鑒評相結合的方法對滋味進行綜合分析,可更為全面的獲得較為客觀的鮮味水解物及調味品。

本文在基于前期對自溶和滋味的變化關系研究和內源酶分離純化研究基礎上,采用酶法水解在25 ℃條件下自溶6 h的蝦頭,以電子舌分析和感官鑒評為主要滋味指標,輔以蛋白質回收率、肽得率和水解度為酶解效率參考指標,逐步優(yōu)化酶解工藝條件,制備具有良好鮮味、高蛋白回收率和營養(yǎng)豐富的蝦頭水解物,為進一步加工成功能性復合調味品提供基料,也為蝦頭的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對蝦蝦頭 取自廣西正五海洋產(chǎn)業(yè)股份公司,鮮活蝦切段后,蝦頭快速凍結到-18 ℃待用;風味蛋白酶(Flavourzyme,40 U/mg)、菠蘿蛋白酶(Bromelain,600 U/mg) 南京都萊生物技術有限公司;木瓜蛋白酶(Papain,800 U/mg)、復合蛋白酶(Protamex,120 U/mg) Solarbio;山梨酸鉀(食品級) 南通奧凱生物技術有限公司;其他所有試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JYL-C022E九陽多功能料理機 九陽有限公司;5418r冷凍離心機 Thermo Scientific;TS-5000Z電子舌 北京盈盛恒泰科技有限責任公司;SKD-800自動凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司;L-8900全自動氨基酸分析儀 日立公司;916 Ti-Touch自動電位滴定儀 瑞士萬通。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解工藝流程 蝦頭自溶:蝦頭→清洗→1%山梨酸鉀浸泡30 s→勻漿→自溶(25 ℃水浴放置6 h)

酶法制備鮮味水解物:自溶蝦頭→調節(jié)pH7.5→添加外源酶→酶解→沸水浴滅酶,15 min→過濾→水解物

酶解過程中每半小時調節(jié)一次pH,使其維持在pH7.5。

1.2.2 酶解工藝的逐步優(yōu)化

1.2.2.1 外源酶的篩選 以前期實驗結果為參考,選擇四種蝦頭中并不存在,具有改善滋味效果而又與蝦頭內源酶具有相似作用條件的商品酶制劑進行酶解,以滋味、酶解效率和氨基酸組成的變化為指標,進行外源酶的篩選,分別為Bromelain、Papain、Protamex、Flavourzyme。稱取5份自溶6 h后蝦頭樣品20.00 g,按料液比1∶2 (g/mL)加入純凈水,調節(jié)pH至7.5,1份作為對照組,其他4份分別加入Bromelain、Papain、Protamex、Flavourzyme四種商品酶進行酶解。根據(jù)肖如武[17]酶解法制備藍蛤水解物時的外源酶選擇實驗為參考,同時從經(jīng)濟成本考慮,以樣品質量的0.1%為加酶量,即加酶量為Bromelain 600 U/g樣品、Papain 800 U/g樣品、Protamex 120 U/g樣品、Flavourzyme 40 U/g樣品,在(55±2) ℃條件下酶解3 h。

1.2.2.2 多酶復合配方的選擇 根據(jù)單酶篩選結果，結合肖如武[17]酶解法制備藍蛤水解物為參考,按以下5個配方進行酶的復合酶解,以滋味和酶解效率為指標,進行最佳復合配方的篩選。配方1:0.09% Bromelain(540 U/g樣品)+0.01% Flavorzyme(4 U/g樣品);配方2:0.07% Bromelain(420 U/g樣品)+0.03% Flavorzyme(12 U/g樣品);配方3:0.05% Bromelain(300 U/g樣品)+0.05% Flavorzyme(20 U/g樣品);配方4:0.03% Bromelain(180 U/g樣品)+0.07% Flavorzyme(28 U/g樣品);配方5:0.01% Bromelain(60 U/g樣品)+0.09% Flavorzyme(36 U/g樣品)。在55±2 ℃條件下酶解3 h。

1.2.2.3 外源酶加酶量的篩選 選定配方2,按108、216、432、864、1296 U/g樣品(分別為樣品質量的0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%)五個水平加酶量,以滋味和酶解效率為篩選指標,在(55±2) ℃條件下酶解3 h進行加酶量探究。

1.2.2.4 料液比的篩選 選用配方2和216 U/g樣品的加酶量,以1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3 (g/mL)五個水平料液比,以滋味和酶解效率為篩選指標,在(55±2) ℃條件下酶解3 h進行酶解工藝的料液比探究。

1.2.2.5 外源酶酶解溫度篩選 選用配方2、216 U/g樣品的加酶量和1∶1.5 g/mL的料液比,以45、50、55、60 ℃四個水平酶解溫度,以滋味和酶解效率為篩選指標,酶解3 h進行酶解溫度探究;

1.2.2.6 外源酶酶解時間篩選 選用配方2、216 U/g樣品的加酶量、1∶1.5 g/mL的料液比和50 ℃的酶解溫度,以酶解1、2、3、4 h四個水平的酶解時間,以滋味和酶解效率為篩選指標，進行酶解時間探究。

1.2.3 感官評價 根據(jù)GB/T12312-90[18]從多名食品科研人員中篩選感官評價人員,選出8名感官人員后,在品評之前對品評人員進行了區(qū)別檢驗和排序檢驗的培訓。鮮味排序實驗根據(jù)GB/T12315[19],感官人員按鮮味特性進行排序,鮮味最強為“1”,依次類推,不同樣品之間無同一秩次。同時,對各樣品的風味進行簡單描述。各個感官評價人員之間互不影響,分開進行評價。感官實驗結果選用GB/T 12315中Friedman檢驗方法對數(shù)據(jù)進行處理。

1.2.4 電子舌測定 根據(jù)實驗室電子舌使用經(jīng)驗,需將樣品固形物含量調至1%,防止測定的味感值超出測定范圍。取2 mL上清液稀釋至35 mL(固形物含量約為1%),在室溫下使用電子舌進行測定。電子舌檢測結果中,均以電子舌測定的第一個樣品為對照組,該樣品各味道數(shù)值均為0,數(shù)值大小直接反映該味道的強弱,不同樣品同一味道的數(shù)值之差大于1,則人體舌頭可感知該味道的變化。

電子舌參數(shù)設置。探頭:AAE(鮮)、CAO(酸)、CTO(咸)、COO(苦)、AE1(澀);測定程序:maintenance measurement;樣品測定次數(shù):4(結果取后3次);清洗次數(shù):2-steps-washing;傳感器:Foodstuff。

1.2.5 酶解效率測定

1.2.5.1 原料中蛋白質含量測定 原料中蛋白質含量測定根據(jù)段杉等[20]測定方法略有修改,稱取勻漿后樣品30.00 g,按料液比1∶4 (g/mL)加入5% NaOH,置于95 ℃水浴2 h進行堿提,7000 r/min離心15 min,取上清液。沉淀重復堿提兩次(每次均用旋渦振蕩器將沉淀搖勻),合并上清液,上清液使用國標GB 5009.5[21]中微量凱氏定氮法結合自動凱氏定氮儀進行測定。

1.2.5.2 酶解液中蛋白質含量測定 稱取酶解液4.00 g,直接使用GB 5009.5中的微量凱氏定氮法進行蛋白質含量的測定。

1.2.5.3 氨態(tài)氮含量的測定 取4.00 g水解液,加去離子水至80.00 g,使用自動電位滴定儀進行氨態(tài)氮測定,詳見甲醛電位滴定法[22]。

1.2.5.4 非蛋白氮測定 原料使用10%TCA浸泡處理后,離心取上清液使用凱氏定氮法進行測定[23]。

蛋白質回收率(%)=水解物中總蛋白氮含量/原料中總蛋白氮含量×100

肽得率(%)=(水解物中總蛋白氮含量-水解物中總氨態(tài)氮含量)/原料中總蛋白氮含量×100

水解度(%)=(水解物中總氨態(tài)氮含量-水解物中游離氨態(tài)氮含量)/(原料中總蛋白氮量-原料液中非蛋白氮含量)×100

1.2.6 氨基酸組成測定 酶解工藝逐步優(yōu)化后,將最終獲得的鮮味水解物進行氨基酸含量的測定。

1.2.6.1 總氨基酸 稱取酶解液2.00 g,加入8 mL 6 mol/L的優(yōu)級純鹽酸;110 ℃水解22 h,每隔一段時間搖勻水解溶液;消解后的樣品溶液過濾并定容至50 mL棕色容量瓶中;吸取1 mL濾液放入10 mL容量瓶中,于60 ℃水浴中趕酸,趕酸完畢后使用超純水定容至10 mL。取定容樣品液過0.22 μm濾膜后,按GB/T 5009.124[24]方法進行氨基酸測定。

1.2.6.2 游離氨基酸 取1 mL酶解液,加入1 mL的5% TCA溶液,振蕩1 min,靜置15 min;4 ℃,10000 r/min離心10 min,將上清液全部轉移至10 mL容量瓶中,使用5%TCA定容至10 mL。將處理好的樣品過0.22 μm濾膜后,按GB/T 5009.124方法進行氨基酸測定。

2 結果與分析

2.1 不同外源酶對水解物的影響

2.1.1 不同外源酶對蝦頭水解物滋味的影響 蝦頭自溶6 h后再經(jīng)四種外源酶分別水解,其水解液滋味經(jīng)感官鑒評后各樣品排序及滋味特征如表1所示,添加不同外源酶獲得的各樣品之間鮮味存在著顯著性差異(p<0.05)。由表1可知,Bromelain水解物和Flavorzyme水解物鮮味優(yōu)于其他水解物,不僅鮮味強,還具有一定的甜味和厚味。而Autolysis水解物則能明顯感覺到苦味,鮮味滋味差。Protamex水解物味道怪異,秩和與Autolysis水解物無明顯差異。Papain水解物滋味一般,鮮味滋味優(yōu)于Autolysis水解物和Protamex水解物,但明顯弱于Bromelain水解物和Flavorzyme水解物。

表1 不同外源酶蝦頭水解物的鮮味排序試驗評分結果Table 1 Ranking test results of the hydrolysate of shrimp heads in different exogenous enzymes on umami taste

以Autolysis水解物作為對照組,對蝦頭水解物進行電子舌分析，結果如圖1所示。不同外源酶的蝦頭水解物在滋味上存在較大變化,其中咸味變化最大。在醬料調味品中,適當?shù)南涛逗退嵛秾︴r味具有提升作用,而咸味過高則會覆蓋鮮味,鮮味與咸味較難區(qū)分,咸味往往決定人們對食品的接受程度[25]。Bromelain和Flavorzyme能有效提高酸味,酸味值均為1.0;Protamex水解物和Flavorzyme水解物咸味值達2.0與3.0,明顯高于其他酶作用效果,可有效提高咸味;而Bromelain、Flavorzyme和Protamex均能降低水解物苦澀味,其中Flavorzyme降低苦味和澀味最明顯,苦味值和澀味值分別為-1.0與-1.2;Protamex和Papain作用使水解物酸味降低,酸味值均為-1.0。因此,Bromelain和Flavorzyme作用可產(chǎn)生適度的咸味和酸味,具有較好增鮮作用,同時降低苦味,使其在鮮味排序實驗中滋味最優(yōu)(秩和為13),其中Flavorzyme中咸味較高,對鮮味滋味具有較大影響。

圖1 不同外源酶蝦頭水解物測定的電子舌雷達圖Fig.1 Radar graph of electronic tongue of the hydrolysate of shrimp heads in different exogenous enzymes

2.1.2 不同外源酶對蝦頭水解物其他指標的影響 不同外源酶對蝦頭其他指標影響如圖2所示,加入不同外源酶后有效提高蝦頭蛋白水解物中的蛋白質回收率和肽得率:Protamex>Papain>Flavourzyme>Bromelain>Autolysis。Autolysis組分的蛋白質回收率為72.99%,肽得率僅為66.84%,而添加外源酶后蛋白質回收率和肽得率中最高(Protamex)可達到92.49%和86.03%,最低(Bromelain)亦可達到80.88%和75.29%。因Bromelain為內切酶,酶切位點有限,而Protamex和Flavourzyme兩者既是內切酶也是外切酶,具有較多酶切位點,故Protamex與Flavourzyme作用后獲得的水解物中蛋白質的回收率和肽得率優(yōu)于Bromelain和Autolysis作用的效果[26]。Bromelain和Flavourzyme作用的水解物水解度最低,其他水解物的水解度相對較高,由此可知,Bromelain和Flavourzyme酶解作用效果相對于其他組分可獲得更多的小分子肽段。鮮味肽結構中一般含有谷氨酸和天冬氨酸的一種或者兩種氨基酸,它具有一定滋味且能增強食品原有的味感[27]。蝦頭中天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)含量較高,可知Bromelain和Flavourzyme酶解作用組分相對于其他組分應含有較多鮮味肽,故該兩種酶作用組分具有較好滋味[28]。

圖2 不同外源酶蝦頭水解物的其他指標Fig.2 The other indexes of the hydrolysate of shrimp heads in different exogenous enzymes注:圖中不同字母表示同一指標各組間差異顯著(p<0.05),圖3、4、6、8、10、12、14同。

2.1.3 不同外源酶對蝦頭水解物氨基酸組成的影響 蛋白質和多肽被內源酶降解產(chǎn)生對滋味具有重大貢獻的游離氨基酸,外源酶作用后，水解液中游離氨基酸組成變化如圖3所示。Flavourzyme水解物和Autolysis水解物的游離氨基酸總量含量明顯高于其他樣品,而Autolysis水解物含有較高的游離苦味氨基酸,Flavourzyme水解物的游離甜味氨基酸總量明顯高于其他樣品,甜味又具有抑制苦味和增加水解物鮮味滋味的效果,同時,Bromelain水解物雖然總游離氨基酸含量低,但其苦味游離氨基酸占總游離氨基酸比例最低(27.52%)。因此,Flavourzyme水解物和Bromelain水解物具有較好滋味,Autolysis水解物滋味差。Protamex水解物和Papain水解物的游離氨基酸含量低,且苦味游離氨基酸含量占總游離氨基酸比例高(分別為33.07%和32.66%),可知該兩種酶作用獲得水解物以苦味滋味為主,滋味較差。

圖3 不同外源酶蝦頭水解物的游離氨基酸變化Fig.3 The changes of free amino acid of shrimp heads in different exogenous enzymes

不同外源酶酶解對水解物總氨基酸組成的影響如圖4。水解物中總氨基酸含量:Flavourzyme>Protamex>Papain>Bromelain>Autolysis,添加外源酶可有效降解蛋白質,獲得水解物中,總氨基酸含量均高于Autolysis水解物。Flavourzyme水解物和Protamex水解物的總氨基含量分別達到2889 mg/100 mL和2751 mg/100 mL,其他組分最高也僅為2306 mg/100 mL,明顯高于其他組分,而Flavourzyme水解物含有較多鮮味氨基酸(22.9%),苦味氨基酸較低(27.9%),Protamex水解物則鮮味氨基酸含量低(12.3%),苦味氨基酸含量高(32.7%),故Flavourzyme水解物中含有較多鮮味物質,鮮味滋味好,Protamex水解物鮮味滋味差。Bromelain水解物雖然總氨基酸含量低,但是苦味氨基酸占總氨基酸比例低(27.0%),且鮮甜味氨基酸占總氨基酸比例高(54.0%),結合圖3數(shù)據(jù)可得,Bromelain水解物中,53%游離鮮甜味氨基酸得到釋放,所以滋味好。氨基酸組成分析結果與感官鑒評和電子舌分析結果基本一致。

圖4 不同外源酶蝦頭水解物的總氨基酸變化Fig.4 The changes of total amino acid of shrimp heads in different exogenous enzymes

綜合感官評價、電子舌和氨基酸組成分析結果可得,通過添加外源酶輔助酶解可改善滋味。單一外源酶作用效果各有優(yōu)點,其中Flavorzyme和Bromelain可獲得較好滋味的鮮味水解物,但Flavorzyme組分具有較高咸味,Bromelain水解物相對其他外源酶獲得的水解物，其酶解效率較低,兩種酶作用效果有限,各自單獨作用效果無法同時達到滋味和酶解效率最優(yōu)。雙酶的協(xié)同作用在理論上會優(yōu)于各自單獨酶解作用效果,故而選用蛋白質回收率和肽得率較高且具有較好鮮味的Flavorzyme和鮮甜味好的Bromelain進行復合酶解[29]。

2.2 多酶復合酶解對蝦頭水解物的影響

2.2.1 多酶復合酶解對蝦頭水解物滋味的影響 對多酶復合酶解蝦頭獲得的水解物進行鮮味排序實驗,結果如表2所示。不同配方獲得的水解物之間存在著顯著性差異(p<0.05),配方1、配方2和配方3獲得水解物的鮮味明顯優(yōu)于其他配方。但配方1帶有腥味,配方3有輕微的澀味,而配方2口感較為柔和,鮮味較單酶作用時也更為濃郁。由前文分析可知,Flavorzyme作用會產(chǎn)生較高咸味,Bromelain作用則苦味較低,且具有一定的甜味,配方1～配方5中,Bromelain含量逐漸降低,Flavorzyme含量逐漸升高,其咸味升高,鮮甜味降低,對水解物滋味的鮮味具有較大影響,配方2的Bromelain和Flavorzyme含量適中,可產(chǎn)生較好的滋味。

表2 不同蛋白酶配方對蝦頭水解物的鮮味排序試驗評分結果Table 2 Ranking test results of the hydrolysate of shrimp heads in autolysis with different protease formulations on umami taste

以配方1樣品作為對照組,對不同配方獲得的水解物進行電子舌分析，結果如圖5所示,可發(fā)現(xiàn)不同配方之間苦澀味感應值變化范圍均小于1,人體舌頭無法明顯感知苦澀味的變化,而咸味感應值變化范圍大于1,所以不同配方獲得水解物配方的滋味變化主要由咸味差異引起,與配方中Flavorzyme逐漸增加導致咸味變化的分析結果相一致。配方1、配方2和配方3的咸味值分別為0、0.1、0.05,而Autolysis水解物、配方4和配方5則為-0.9、-1.2和-1.0,且配方4與配方5苦澀味較高,因此,配方1、配方2和配方3可提高水解物中咸味,具有增鮮作用,滋味較好,在表2鮮味排序實驗中具有較好鮮味,配方4和配方5獲得的水解物滋味較差。配方2在鮮味排序實驗中最優(yōu)(秩和為16),可說明配方2獲得水解物中咸味適宜,優(yōu)于配方1和配方3。

圖5 電子舌對不同蛋白酶配方蝦頭水解物測定的雷達圖Fig.5 Radar graph of electronic tongue of the hydrolysate of shrimp heads in different protease formulations

2.2.2 多酶復合酶解對蝦頭水解物其他指標的影響 不同蛋白酶配方對蝦頭水解物酶解效率的影響如圖6所示,可發(fā)現(xiàn)各配方酶解效率均明顯高于Autolysis水解物,有效提高酶解效率,其中配方5與配方1具有較好酶解效率,蛋白質回收率達87.22%與83.78%,肽得率為80.99%與76.84%。配方2、配方3、配方4酶解效率則相對較差。復配酶解由于協(xié)同作用可有效提高酶解效果,其蛋白質回收率和肽得率優(yōu)于Flavourzyme和Bromelain單酶作用。不同配方獲得的水解物,蛋白質回收率范圍在80.12%～87.23%,肽得率范圍在73.15%～80.99%之間,水解度之間差異較小,均明顯高于僅自溶作用獲得的水解物。

圖6 不同蛋白酶配方蝦頭水解物的其他指標Fig.6 The other indexes of the hydrolysate of shrimp heads in different protease formulations

滋味和酶解效率綜合分析后,配方1酶解效率明顯優(yōu)于配方2,但在水解物中,滋味對調味品作用更為重要。配方2在滋味上明顯突出鮮味,且配方2酶解效率相較于Autolysis水解物亦有明顯提高,故選用配方2進行輔助酶解。

2.3 加酶量對蝦頭水解物的影響

2.3.1 加酶量對蝦頭水解物滋味的影響 不同加酶量對蝦頭水解物鮮味排序結果如表3所示,不同外源酶添加量可對滋味造成顯著性影響(p<0.05),108 U/g樣品和216 U/g樣品加酶量獲得的水解物在排序實驗中秩和為14與18,明顯高于其他樣品秩和(29、31、33、48),擁有蝦米味和良好的鮮味。使用配方2進行輔助酶解,所得樣品均有滋味上的提升,其中滋味提升最好的是加酶量216 U/g樣品。評價人員均可辨別出未添加外源酶的樣品(秩和48),該樣品相對于其他樣品滋味差、怪異。隨著加酶量的提升,酶對蝦頭的酶解效果發(fā)生變化,當酶量較少時,蛋白質分子并未完全降解為小分子肽段與氨基酸,滋味物質較少;而酶量較高,過度的水解會產(chǎn)生較多的氨基酸,導致了水解物中氨基酸含量提升,同時苦味氨基酸含量也提升,而鮮味肽含量減少,故而滋味變差。因此,

表3 不同加酶量蝦頭水解物的鮮味排序試驗評分結果Table 3 Ranking test results of the hydrolysate of shrimp heads in different dosage of protease

隨著加酶量的變化對滋味上有較大變化,其中108 U/g樣品和216 U/g樣品加酶量酶解效果具有較好滋味。

電子舌測定結果以108 U/g樣品加酶量組分樣品作為對照組,結果如圖7所示?？砂l(fā)現(xiàn)不同加酶量主要改變了水解物的苦味和咸味。隨著加酶量增加,水解物咸味呈現(xiàn)遞增趨勢,其中1296 U/g樣品加酶量水解物咸味值達到3,明顯高于其他水解物,容易覆蓋鮮味;864 U/g樣品加酶量苦味值達1.8,明顯高于其他水解物,咸味值-2.2,明顯低于其他水解物;216 U/g樣品和432 U/g樣品加酶量獲得的水解物苦味值分別為-0.2和-0.5,咸味值為0.6和1.2。因此,216 U/g樣品和432 U/g樣品加酶量獲得水解物具有較好的增鮮作用的咸味值,滋味較好,與排序實驗結果基本一致。

圖7 電子舌對不同加酶量蝦頭水解物測定的的雷達圖Fig.7 Radar graph of electronic tongue of the hydrolysate of shrimp heads in different dosage of protease

2.3.2 加酶量對蝦頭水解物其他指標的影響 不同加酶量獲得水解物的酶解效率結果如圖8所示。可發(fā)現(xiàn)隨著加酶量的增加,蛋白質回收率和肽得率都是呈現(xiàn)一種先升高后降低的趨勢,而水解度則是先降低后升高。在加酶量為216 U/g樣品時,蛋白質回收率和肽得率最高且水解度最低,分別為79.81%、74.68%和15.05%,含有較多小分子肽。因為酶解是酶與底物特異性結合分解底物的過程,在底物濃度一定的情況下,隨著酶添加量的增加,特異性結合復合物增多，使得加酶量與反應速度成正相關,故酶解效率增加。當酶添加量與底物結合飽和之后,繼續(xù)加酶不會增加反應速度,同時,酶之間還可能存在相互水解作用,加酶量少時,相互作用不明顯,而加酶量大時,相互作用明顯,可能導致酶活力降低而對酶解效果影響較大[30]。加酶量216 U/g樣品的水解物相較于加酶量108 U/g樣品的水解物可提高4%蛋白質回收率,且滋味上也具有良好鮮味,故選擇216 U/g樣品加酶量。

圖8 不同加酶量的蝦頭水解物其他指標Fig.8 The other indexes of the hydrolysate of shrimp heads in different dosage of protease

2.4 料液比對蝦頭水解物的影響

2.4.1 料液比對蝦頭水解物滋味的影響 鮮味排序實驗結果見表4,不同料液比的樣品之間存在顯著性差異(p<0.5),料液比1∶1.5 (g/mL)的水解物與1∶1 (g/mL)的水解物在鮮味滋味上明顯優(yōu)于其他樣品,其中料液比1∶1.5 (g/mL)的水解物鮮味佳且無明顯腥味。料液比高于1∶2 (g/mL)時,滋味一般,鮮味較弱,可能是由于加水量多,水解物被稀釋。

表4 不同料液比對蝦頭水解物的鮮味排序試驗評分結果Table 4 Ranking test results of the hydrolysate of shrimp heads in different ratio of solid to liquid

由圖9可知，以料液比1∶1 (g/mL)獲得水解物作為對照組,不同料液比對水解物各滋味影響顯著。料液比1∶3獲得水解物鮮味值最高(0.6),但其苦味值為3,顯著高于其他料液比,具有增鮮作用的咸味值為-3.3,明顯低于其他水解物;料液比1∶2 (g/mL)獲得的水解物咸味值和酸味值分別為-0.5和-1.2,增效效果差;料液比1∶2.5 (g/mL)獲得水解物的咸味值和酸味值分別為-0.7和1.0,增鮮效果較差;料液比1∶1.5 (g/mL)的水解物雖然鮮味最低(-0.8),但是苦味和澀味分別為-1.0和-1.5,明顯降低,咸味和酸味為3.0和2.0,可有效增鮮。故滋味上料液比1∶1 (g/mL)與料液比1∶1.5 (g/mL)獲得的水解物具有較好滋味,在感官滋味評分上具有較高得分。

圖9 電子舌對不同料液比蝦頭水解物測定的雷達圖Fig.9 Radar graph of electronic tongue of the hydrolysate of shrimp heads in different ratio of solid to liquid

2.4.2 料液比對蝦頭水解物其他指標的影響 不同料液比對蝦頭水解物酶解效率影響如圖10所示?？砂l(fā)現(xiàn)不同料液比之間的蛋白質回收率、肽得率、水解度差異明顯,三者隨著料液比增加而增加,效果最好時(料液比1∶3 (g/mL))分別達到81.90%、75.40%、19.06%。在酶解過程中，水作為運輸載體,同時又是反應的介質,不同的料液比可影響酶與底物的結合,間接的影響酶解效果。在理論上,水量增加會讓底物與酶變得更加松散,使得底物與酶接觸面積增大,結合位點增加,促進酶解,當達到底物與酶的結合位點飽和后,酶解速度不再增加,因此,隨著料液比增加,酶解速度呈現(xiàn)上升后平緩的趨勢,增加速度也趨于減緩[30]。因加水量過多則對應產(chǎn)物需要濃縮耗費成本,并且需要較大反應容器及場地。綜合滋味、酶解效率和實際生產(chǎn)分析后,選用料液比1∶1.5 (g/mL)適宜。

圖10 不同料液比的蝦頭水解物其他指標Fig.10 The other indexes of the hydrolysate of shrimp heads in different ratio of solid to liquid

2.5 酶解溫度對蝦頭水解物的影響

2.5.1 酶解溫度對蝦頭水解物滋味的影響 配方2中含有兩種酶,兩種酶的最適溫度存在一定的差異,不同的溫度對酶的反應作用具有顯著的影響,從而導致配方2對水解物的酶解效率和滋味產(chǎn)生差異,同時,酶解工藝溫度的研究對酶的有效利用和工廠化實際應用具有重要參考意義。不同酶解溫度對滋味影響如表5所示,不同樣品滋味之間存在顯著差異(p<0.5)。酶解溫度為50 ℃獲得的酶解液滋味顯著優(yōu)于45 ℃和60 ℃獲得的酶解液，50 ℃與55 ℃酶解溫度獲得的水解物秩和分別為12與17,兩樣品得分差值小于LSD值(10.12),在鮮味上無明顯差異,但55 ℃獲得水解物有輕微苦味。

表5 不同酶解溫度的蝦頭水解物的鮮味排序試驗評分結果Table 5 Ranking test results of the hydrolysate of shrimp heads in different temperature

以45 ℃酶解溫度獲得的水解物作為對照組,電子舌對不同酶解溫度獲得的蝦頭水解物的滋味分析結果如圖11所示?？砂l(fā)現(xiàn)鮮味值和澀味值變化范圍小于1,不同酶解溫度主要通過對咸味、酸味和苦味的影響改變了水解物滋味。根據(jù)滋味的綜合呈味效果可知,適宜的咸味和酸味可增鮮,應盡量降低水解物中苦澀味。60 ℃酶解溫度獲得水解物是澀味值和咸味值分別為0.8和1.8,澀味高,且過高咸味易覆蓋鮮味;55 ℃酶解溫度獲得的水解物苦味值和咸味值分別為1.3和-1.0,其苦味高,具有增鮮作用的咸味低;45 ℃酶解溫度獲得的水解物咸味值和酸味值均為0,低于50 ℃和60 ℃酶解溫度獲得的水解物;50 ℃酶解溫度獲得的水解物咸味值和酸味值均為1,苦澀味較低。因此,45 ℃和55 ℃和60 ℃酶解溫度下獲得的水解物在不同程度上具有一定的苦澀味,同時具有增鮮作用的酸味和咸味兩種滋味較低,故50 ℃酶解溫度獲得水解物具有良好滋味。

圖11 電子舌對不同酶解溫度的蝦頭水解物測定的雷達圖Fig.11 Radar graph of electronic tongue of the hydrolysate of shrimp heads in different temperature

2.5.2 酶解溫度對蝦頭水解物其他指標的影響 不同酶解溫度的酶解效率結果如圖12所示,隨著溫度升高,蛋白質回收率、肽得率和水解度均為先升高趨于平緩后再降低。因50 ℃和55 ℃在Flavorzyme和Bromelain的最適作用溫度區(qū)間,所以在此兩溫度下的酶解效率高于其他溫度。50 ℃酶解溫度獲得的水解物滋味好且酶解效率高,綜合滋味和酶解效率分析后,選擇酶解溫度為50 ℃。

圖12 不同酶解溫度的蝦頭水解物的其他指標Fig.12 The other indexes of the hydrolysate of shrimp heads in different temperature

2.6 外源酶酶解時間對蝦頭水解物的影響

2.6.1 外源酶酶解時間對蝦頭水解物滋味的影響 外源酶酶解時間對蝦頭水解物鮮味排序實驗結果如表6所示,不同酶解時間對水解物滋味具有顯著影響(p<0.5),其中酶解時間3 h的水解物具有最好滋味,口感柔和且鮮味良好,與酶解1 h和2 h獲得水解物之間存在顯著性差異。

表6 不同酶解時間對蝦頭水解物的 鮮味排序試驗評分結果Table 6 Ranking test results of the hydrolysate of shrimp heads in different enzymatic hydrolysis time

以外源酶酶解1 h獲得的水解物作為對照組,電子舌對不同外源酶酶解時間獲得水解物的電子舌測定結果如圖13所示。不同外源酶酶解時間對水解物的咸味和酸味影響顯著,其他滋味的響應值變化范圍均小于1,人體舌頭不易感知其變化。酶解1 h樣品的咸味、酸味和厚味明顯低于其他組分;酶解2 h樣品咸味值和酸味值分別為2.0和0.7,咸味過高易覆蓋鮮味,酸味較低,故在鮮味滋味上差;酶解4 h樣品咸味值和酸味值為1.4和1.2,酶解3 h樣品咸味和酸味分別為1.2和1.1,兩樣品的咸味和酸味適中,故具有較好鮮味滋味。

圖13 電子舌對不同酶解時間蝦頭水解物測定的雷達圖Fig.13 Radar graph of electronic tongue of the hydrolysate of shrimp heads in different enzymatic hydrolysis time

2.6.2 外源酶酶解時間對蝦頭水解物其他指標的影響 酶解效率如圖14,可發(fā)現(xiàn)外源酶酶解3 h樣品的蛋白質回收率和肽得率最高,分別為79.75%和71.71%。因為在最初加入外源酶時,由于底物充足,酶解速度較快,以降解蛋白質為主,隨著酶解時間增加,底物開始減少,肽分子與底物接觸幾率增加,所以蛋白質分解速率降低,肽分解速率升高,肽得率降低,同時水解度上升。綜合分析得外源酶酶解時間3 h為宜。

圖14 不同酶解時間蝦頭水解物的其他指標Fig.14 The other indexes of the hydrolysate of shrimp heads in different enzymatic hydrolysis time

2.7 獲得的鮮味水解物的氨基酸組成

滋味主要成分來源于原料中蛋白質的降解生成的呈味多肽和氨基酸,或其蛋白質水解物轉化為相關的衍生物[31]。因此,游離氨基酸組成對水解物滋味具有重大貢獻。其中鮮甜味氨基酸能掩蓋苦味氨基酸帶來的不好滋味,鮮甜味和苦味與人們是否接受該食物密切相關[32]。通過工優(yōu)化后獲得的鮮味水解物氨基酸組成如表7所示。獲得水解物的游離氨基酸組成中,游離鮮甜味氨基酸占總游離氨基酸的47%,與鮮味形成具有關鍵作用的游離谷氨酸和游離天冬氨酸共占總游離氨基酸的12%,游離鮮甜味氨基酸含量明顯高于游離苦味氨基酸,故具有良好的鮮味。獲得的水解物總氨基酸組成中,鮮甜味氨基酸占總氨基酸52%,苦味氨基酸占僅總氨基酸的29%,ΣEAA/ΣAA與ΣEAA:ΣNEAA分別為37%和1∶1.7。水解物的總游離氨基酸占總氨基酸的65%,總游離苦味氨基酸占總氨基酸的23%。游離鮮甜味氨基酸占總鮮甜味氨基酸的59%,其中游離鮮味氨基酸占總鮮味氨基酸的36%,游離甜味氨基酸占總甜味氨基酸的77%。可知優(yōu)化酶解工藝后,降低了苦味,同時釋放出大量鮮甜味氨基酸,有效的改善了水解物滋味。酶法水解動物蛋白具有多種呈味氨基酸、呈味肽以及多種風味物質,能使蛋白水解物具有良好滋味,尤其鮮味突出,可應用于高級調味品的生產(chǎn)和功能性食品的基料,許多發(fā)達國家已經(jīng)使用動物水解蛋白作為高檔調味品和湯料[33]。王彥蓉等[34]在羅非魚皮酶解液中分離出具有除腥味作用的小分子肽,在調味品方面具有極大的應用價值。本研究獲得的水解物氨基酸種類齊全,具有高營養(yǎng)價值和良好的風味基礎,在理論上也是一種制備調味品的優(yōu)質基料,可進一步加工成調味品。

表7 鮮味水解物游離氨基酸組成(mg/100 mL)Table 7 Total free amino acids composition and content of the Hydrolysate with umami(mg/100 mL)

3 結論

感官鑒評結合電子舌對南美白對蝦蝦頭水解物制備過程滋味變化進行分析可知,四種外源酶對滋味改善具有明顯差異,Bromelain和Flavourzyme兩種外源酶對滋味改善具有較好作用,Papain 改善滋味效果一般,而Protamex滋味改善效果最差。通過對酶解工藝逐步優(yōu)化確定最佳的反應條件為:蝦頭25 ℃自溶6 h,加入Bromelain(420 U/g樣品)和Flavorzyme(12 U/g樣品)兩種酶(料液比1∶1.5 (m∶v)),pH7.5、50 ℃下進行雙酶復合酶解3 h。該酶解工藝條件下可獲得的水解物,蛋白回收率79.76%、肽得率71.71%、水解度18.28%;氨基酸組成中,游離氨基酸占總氨基酸65%,游離苦味氨基酸占總氨基酸的23%,游離鮮甜味氨基酸占總氨基酸52%,游離鮮甜味氨基酸占總鮮甜味氨基酸的59%,游離鮮味氨基酸占總鮮味氨基酸的36%,游離甜味氨基酸占總甜味氨基酸的77%?？偘被嶂笑睧AA/ΣAA與ΣEAA∶ΣNEAA分別為37%和1∶1.7。該工藝有效的提高了蝦頭蛋白的酶解效率,大量鮮甜味氨基酸得到釋放,獲得的水解物氨基酸組成營養(yǎng)價值高且具有良好鮮甜味滋味,是一種優(yōu)質的調味品基料。