缺血后處理對糖尿病大鼠腦缺血再灌注后腦組織SOCS-3及TNF-α表達的影響

糖尿病的發(fā)病率已呈現(xiàn)逐年上升的趨勢,作為腦梗死的獨立危險因素之一,有研究表明,糖尿病和(或)高血糖狀態(tài)會使腦缺血再灌注(I/R)損傷進一步加重,但具體機制尚不明確[1]。缺血后處理(IP)作為一種新干預策略誘導缺血耐受,在腦缺血早期給予短暫的I/R處理,可明顯減輕腦組織損傷,具有重要的內源性神經保護[2]。但是至今IP對腦I/R損傷的作用和機制,尤其是在合并糖尿病的腦I/R損傷中的具體機制仍未闡明。炎癥負性調控細胞因子信號轉導抑制因子3(SOCS-3)作為一種神經保護標志物,對腫瘤壞死因子α(TNF-α)等在內的多種炎性細胞因子起著負性調控作用,其在腦I/R損傷中的表達及作用機制是近年來研究的熱點[3]。故本實驗通過建立糖尿病大鼠局灶性腦I/R模型,觀察IP對SOCS-3、TNF-α表達水平的影響,以進一步探討其可能的作用機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 (1)實驗動物及分組:選用115只健康雄性SD大鼠,體質量160～180 g,由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供。將其隨機分為2組:糖尿病組(105只)及普通組(10只)。建立糖尿病模型后,將糖尿病大鼠隨機分為sham組、I/R組和IP組各35只,各組以腦缺血90 min再灌注后的不同時間點(3 h,6 h,12 h,24 h,48 h,72 h)分為6個亞組,除24 h組為10只(其中5只用于TTC染色測定腦梗死體積)外,其余每個亞組5只。(2)主要試劑:鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma公司);兔抗大鼠SOCS-3多克隆抗體、兔抗大鼠TNF-α多克隆抗體(美國 BIoworld公司);DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 研究方法 動物模型制備:普通組予以普通飼料喂養(yǎng),糖尿病組參考林心君等[4]的高脂高糖配方飼料予以喂養(yǎng)4周,進行2次STZ腹腔注射[25 mg/(kg·m2),間隔2 d],制備糖尿大鼠病模型。經10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,成功后將其仰臥固定于解剖架上,充分并暴露頸部組織。I/R組依照改良Longa[5]法制作大鼠右側大腦中動脈I/R模型,缺血90 min后輕拔出栓線實施再灌注;IP組采用孫靜等[6]的方法,于缺血90 min后拔出栓線5 mm,進行灌注15 s/閉塞15 s,重復3次后拔出拴線實現(xiàn)永久灌注。sham組僅暴露右側頸總動脈及分叉處,不行線栓,其余步驟同手術組。大鼠造模清醒后根據Longa[5]的評分原則評價造模是否成功,不符合標準的予以剔除，再后續(xù)補足。

1.3 觀察指標

1.3.1 神經功能缺損評分:在缺血再灌注術后各時間點,依據Garcia[7]原則對大鼠神經功能進行評分,18分為最高分,3分為最低分,得分越低則神經功能障礙越重。

1.3.2 TTC染色測定術后24 h腦梗死體積:選取各組術后24 h大鼠(5只)予以麻醉處死,立即斷頭取腦,并去除低位腦干及小腦,冠狀切片約(2 mm)行TTC避光染色,正常腦組織為紅色,梗死腦組織為蒼白色。對各切片拍照后用Image Pro Plus 5.1圖像分析處理圖片,以公式V=(A1+…+An)t/2測定腦梗死體積,其中t為切片厚度(mm),A為梗死體積(mm3)。

1.3.3 免疫組織化學法檢測腦組織SOCS-3、TNF-α的表達:各組大鼠分別于造模后不同時間(3 h,6 h,12 h,24 h,48 h,72 h)予以麻醉處死,立即斷頭取腦,并去除低位腦干及小腦。將所取新鮮腦組織于4%的多聚甲醛中固定,石蠟包埋,切片(厚3μm),置于載玻片上,4 ℃保存。將備用切片參照試劑盒具體說明進行操作,于400倍高倍鏡下觀察,胞質、胞核呈棕黃色為SOCS-3、TNF-α表達陽性的細胞,分別選取5個不重復視野進行陽性細胞計數,取平均值。

1.3.4 TUNEL法檢測神經元凋亡細胞表達:將備用切片參照TUNEL染色試劑盒具體說明進行操作,于400倍高倍鏡下觀察,胞核呈棕色為陽性凋亡細胞,分別選取5個不重復視野進行陽性細胞計數,取平均值。

2 結果

2.1 糖尿病模型 參考林心君等[4]的糖尿病大鼠成模標準:隨機血糖≥16.7 mmol/L和(或)2次禁食血糖(FBG)≥11.1 mmol/L,測大鼠尾靜脈血糖濃度,糖尿病組比普通組大鼠顯著增高(P<0.05),表明糖尿病大鼠造模成功。

2.2 神經功能缺損評分 sham組無神經功能缺損癥狀,I/R組和IP組再灌注后不同時間點神經功能評分均低于sham組(P<0.05),與I/R組比較,IP組各時間點評分顯著增高(P<0.05),且2組神經功能缺損評分均在24 h時最低。見表1。

表1 各組不同時間點神經功能缺損評分比較分，n=5)

注:與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,△P<0.05

2.3 術后24 h腦梗死體積 根據TTC染色結果,sham組中未見梗死灶,I/R和IP組均可見蒼白色梗死灶,且IP組梗死灶體積較I/R組顯著減小[(163.60±12.10) mm3比(198.20±9.73) mm3,P<0.05]。

2.4 各組大鼠腦組織SOCS-3和TNF-α的表達 根據免疫組化檢測結果,SOCS-3和TNF-α在sham組中可見微量表達,但無動態(tài)變化,其在I/R組中的表達于3 h開始升高,24 h達高峰,之后逐漸下降,在72 h仍有少量表達,IP組表達趨勢與I/R組相同,但IP組中各時間點SOCS-3表達較I/R組明顯升高(P<0.05)，TNF-α表達較I/R組明顯降低(P<0.05),且I/R和IP組各時間點表達均高于sham組(P<0.05)。見表2,3。

表2 各組不同時間點腦組織SOCS-3陽性細胞數比較個/視野,n=5)

注:與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,△P<0.05

表3 各組不同時間點腦組織TNF-α陽性細胞數比較個/視野,n=5)

注:與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,△P<0.05

2.5 各組大鼠凋亡細胞表達 根據TUNEL法檢測結果,sham組僅見極少的凋亡細胞,I/R組中凋亡細胞于3 h開始升高,24 h達高峰,之后逐漸下降;IP組中表達趨勢與I/R組相似,但IP組各時間點較I/R組表達明顯減少(P<0.05);且I/R和IP組中各時間點凋亡細胞表達均較sham組顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組不同時間點腦組織凋亡細胞數比較個/視野,n=5)

注:與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,△P<0.05

3 討論

糖尿病是一組由遺傳及環(huán)境等多因素引起的,以高血糖為特征的代謝性疾病。作為臨床多發(fā)病、常見病,糖尿病與腦缺血損傷密切相關,臨床研究證實,糖尿病不但能誘發(fā)腦缺血,而且會使腦缺血損傷進一步加重,糖尿病合并腦缺血病人預后更差[8], 故本實驗以糖尿病大鼠為基礎建立腦I/R模型更符合腦缺血的自然發(fā)病進程。恢復血流是腦缺血的治療原則,但血流恢復后會造成不可避免的I/R損傷。Zhao等[9]研究結果顯示, 在腦I/R時行IP,腦梗死體積及神經元凋亡顯著減少,可實現(xiàn)缺血保護作用。本實驗參考孫靜等[6]的腦I/R模型,反復3次的再灌注15 s/缺血15 s為IP發(fā)揮神經保護的最佳時間,經反復預實驗,這種IP措施能產生神經保護作用。

腦I/R損傷是多機制參與的病理生理過程,包含炎癥反應、自由基生成、細胞凋亡等,其中炎癥級聯(lián)反應起著重要的作用。TNF-α是一種前炎性反應因子,具有細胞毒性和促炎性作用,是腦缺血損傷轉向炎癥損傷的核心基礎。在腦I/R時，炎癥反應被激活,TNF-α等大量炎性細胞因子釋放,激發(fā)血管內皮細胞釋放舒縮血管活性物質,破壞血腦屏障,造成神經元損傷,同時還可啟動炎性級聯(lián)反應,進一步加重I/R損傷,故抑制炎性因子的表達對減輕腦I/R損傷有重要意義。SOCS-3作為一種內源性抑制因子,通過抑制JAK/STAT途徑,對TNF-α等大量炎性因子的信號轉導起負性調控,可達到抑制炎性因子表達及細胞凋亡的作用。

Bate等[10]的研究發(fā)現(xiàn),在腦缺血側腦組織呈現(xiàn)SOCS-3 mRNA高表達,并在12 h達高峰,在24 h仍有一定表達。Raghavendra等[11]的研究發(fā)現(xiàn),若反義減少SOCS-3的表達,梗死體積明顯增高,神經功能缺損加重。而予以腺病毒載體過度的SOCS3表達后,梗死體積明顯縮小[12]。故認為SOCS-3在I/R損傷中起保護作用。本實驗結果與以往研究基本相同,發(fā)現(xiàn)I/R后SOCS-3表達增高,IP能上調其表達。Yin等[13]研究發(fā)現(xiàn),缺血側腦組織TNF-αmRNA在24 h出現(xiàn)高峰,隨后逐漸下降。He等[14]研究發(fā)現(xiàn),在大鼠腦I/R后3 h,TNF-α開始表達并在24 h達高峰,減少其表達或抑制其活性可減輕腦損傷,提示TNF-α可能與腦I/R損傷有關。且在此之前有學者在腦I/R模型中用TNF-α抗體中和TNF-α后,大鼠神經功能缺損有明顯改善[15]。本實驗研究結果顯示，I/R后TNF-α表達增高,IP能減少其表達,與上述文獻報道相符,而且TNF-α與SOCS-3變化趨勢相同,說明腦IP可通過內源性神經保護機制上調SOCS-3表達,減少TNF-α表達,減輕炎癥反應。同時TUNEL法測得凋亡細胞結果顯示,I/R 組在3 h 可檢測到凋亡細胞的表達,隨著再灌注時間延長，凋亡細胞表達增多,于24 h 達到高峰,IP組凋亡細胞的表達明顯減少,結合上述 TNF-α的表達可發(fā)現(xiàn),凋亡細胞表達趨勢與 TNF-α趨于一致,且24 h梗死體積測定結果顯示,IP組梗死體積較I/R組明顯縮小,說明在I/R后TNF-α等炎性因子表達增加,可通過激活JAK/STAT通路,引起組織損傷及細胞凋亡,同時I/R損傷本身也增加SOCS-3表達,抑制炎癥反應,IP通過增加SOCS-3表達,負性調節(jié)JAK/STAT通路,減少TNF-α過量表達,從而抑制腦組織炎癥反應,減少細胞凋亡,縮小梗死體積,達到腦保護作用。

綜上所述,TNF-α在腦I/R中起重要作用,IP可通過增加SOCS-3表達抑制TNF-α表達,從而激發(fā)內源性腦保護,減輕腦I/R損傷。但由于本實驗采用糖尿病大鼠制作腦I/R模型,與既往相似研究相比炎性因子表達較高。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病會使腦內毒性物質蓄積、腦I/R損傷中重要蛋白表達改變以及內源性保護性物質生成減少,可使腦組織在誘發(fā)缺血耐受時,達不到產生缺血耐受的閾值而弱化腦IP保護作用[16-17],但具體機制尚不清楚,還有待進一步研究。