電針“太沖”“百會(huì)”對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎組織ACE2、Ang(1-7)表達(dá)及Ang(1-7)/AngⅡ比值的影響*

袁靜云，紀(jì) 智，王紫娟，張 躍，張 月，宋 軍，李昇洙，劉清國(guó)

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

高血壓病是一種嚴(yán)重危害公眾健康的心血管疾病，2014年《中國(guó)心血管病年度報(bào)告》中指出，我國(guó)高血壓病的患者數(shù)已達(dá)2億，且近年來(lái)，我國(guó)因高血壓導(dǎo)致的終末期腎病ESRD(end-stage renal disease) 逐年上升[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensinsystem, RAS)在調(diào)節(jié)水鹽代謝、維持血容量與血管張力以及調(diào)控心、腎臟功能等方面功效顯著，且與血壓的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，RAS調(diào)控血壓主要有兩條通路[2-5],一條由血管緊張素Ⅰ(Angi-otensinⅠ，AngⅠ)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)、血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)以及血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)組成的縮血管通路。ACE可分解AngⅠ生成 AngⅡ，AngⅡ與 AT1R 結(jié)合，整個(gè)過(guò)程具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、增加水鈉潴留和強(qiáng)烈收縮血管等作用。另一條則是AngⅡ-ACE2-Ang(1-7)-Mas受體組成的舒血管通路，ACE2分解 AngⅡ，生成Ang(1-7)，Ang(1-7)與 Mas 受體結(jié)合，具有抗增殖、調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡、舒張血管和降低血壓等作用。有報(bào)道稱(chēng)針刺可以有效改善早期腎損害的癥狀[6-9]，研究發(fā)現(xiàn)，捻轉(zhuǎn)瀉法可能通過(guò)降低SHR大鼠腎臟腎素和AngⅡ的含量從而對(duì)腎臟起到保護(hù)作用[10]。但目前針刺對(duì)腎RAS系統(tǒng)中舒血管通路的影響尚不明確。本研究通過(guò)觀察電針“太沖”“百會(huì)”對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎組織ACE2、Ang(1-7)舒血管活性因子的表達(dá)和AngⅡ/Ang(1-7)比值的影響，探究針刺對(duì)腎RAS系統(tǒng)中舒血管通路的作用，進(jìn)而探討其對(duì)高血壓腎損害的可能保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)24 只，220～250 g，Wistar-Kyoto(WKY)大鼠 12只，體質(zhì)量220～250 g。所用大鼠均為雄性，12周齡，購(gòu)自“北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心[許可證號(hào): SCXK (京) 2012-0001]。WKY大鼠12只作為空白組。利用隨機(jī)數(shù)字表法將SHR大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組，每組各12只。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的各項(xiàng)處理均遵照中華人民共和國(guó)科技部2006年頒布的有關(guān)動(dòng)物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 主要儀器與試劑

漢醫(yī)牌針灸針(北京漢醫(yī)醫(yī)療器械)；韓氏穴位神經(jīng)刺激儀：LH200H(聯(lián)創(chuàng)科技集團(tuán)南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)；XH200型恒溫式無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x(北京眾實(shí)科技有限公司);高速冷凍離心機(jī)(北京翔意信科數(shù)碼科技有限公司)；BCA蛋白測(cè)定試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；蛋白裂解緩沖液(北京優(yōu)科卓業(yè)生物有限公司)；VE186 TBC(上海天能科技有限公司)；均質(zhì)器(Fluko)；電泳儀(DYCP-31E，北京六一廠)；電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo，USA)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)；ELISA定量檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；兔抗ACE2多克隆抗體(上海塞齊生物有限公司)；Leica UC7超薄切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；2.5% Gluta電鏡專(zhuān)用固定液(北京索萊寶科技有限公司)；HT-7700型透射電鏡(日本 HITACH 公司)。

1.3 針刺方法

“太沖”“百會(huì)穴”，取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》教材大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位(林文柱、王佩編)[11]，于后肢足背1、2趾骨凹陷處取太沖穴，于前正中線，兩耳尖連線中點(diǎn)取百會(huì)穴，電針組大鼠采用0.18 mm×13 mm毫針?lè)謩e于“百會(huì)”、雙側(cè)“太沖穴”直刺1～2 mm，太沖(右)和百會(huì)連接韓式電針儀兩極，電流強(qiáng)度1 mA，頻率2 Hz/15 Hz，留針20 min。針刺時(shí)間集中在每天上午8：00—11：00之間，連續(xù)治療30天。模型組和空白組每日在相同時(shí)間進(jìn)行與針刺組相同的捉抓固定刺激。

1.4 血壓的測(cè)量

在室溫(22±2)℃條件下，將清醒狀態(tài)下的大鼠于36℃下預(yù)熱約15 min，待大鼠狀態(tài)穩(wěn)定后，用無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)量大鼠安靜、清醒狀態(tài)尾壓，連續(xù)測(cè)量3次，取其收縮壓均值。血壓每6天測(cè)量1次，即治療前1天、治療第6、12、18、24、30天時(shí)測(cè)量血壓。測(cè)壓時(shí)的注意事項(xiàng)：①正式測(cè)壓前訓(xùn)練若干次；②實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要保持安靜；③測(cè)量過(guò)程中操作者應(yīng)動(dòng)作輕柔，以免因激惹大鼠而導(dǎo)致其血壓波動(dòng)；④大鼠網(wǎng)套大小要合適，以免逃脫；⑤加溫時(shí)間不能太長(zhǎng)，一般固定在15 min左右，以免使大鼠悶死。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 血清尿酸(UA)和尿素氮(BUN)及腎組織AngⅡ、Ang(1-7)的測(cè)定 離心機(jī)分離血清，使用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定血清尿酸和尿素氮的水平。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，推測(cè)出各個(gè)檢測(cè)因子的濃度。

1.5.2 Western blot檢測(cè)腎臟ACE2的表達(dá) 將大鼠的腎臟提取總蛋白后，用BCA法測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度一致，加入蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min使蛋白變性，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(Anti-ACE2)稀釋比例分別為1∶2 000和1∶4 000，置于搖床4℃過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次5 min，加HRP標(biāo)記的二抗(1∶4 000)，室溫?fù)u床孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，將條帶置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行曝光，條帶運(yùn)用Gel Image ststem ver.4.00(tanon,china)軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值，內(nèi)參為GAPDH。

1.5.3 HE染色和Masson染色 腎組織4%甲醛固定，常規(guī)包埋，切成4 μm薄片，先后置于鐵蘇木素、麗春紅酸性品紅液、磷鉬酸水溶液、苯胺藍(lán)液浸染后脫水，二甲苯透明樹(shù)膠封片，光鏡下觀察腎組織形態(tài)改變。

1.5.4 電鏡觀察腎臟結(jié)構(gòu) 左腎靠近下極處切取約1 mm3大小的組織2～3塊，2.5%戊二醛固定2 h后，以1%的鋨酸·0.1 M磷酸緩沖液PB后固定2 h，以乙醇丙酮進(jìn)行梯度脫水，812環(huán)氧樹(shù)脂進(jìn)行包埋，Leica UC7超薄切片機(jī)切60～80 nm薄片后，以2%醋酸鈾酒精溶液和枸櫞酸鉛分別浸染15 min,最后將切片置于透射電鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療前后收縮壓比較

治療前模型組和電針組大鼠收縮壓均高于空白組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，模型組和電針組收縮壓則無(wú)差異(P>0.05)，治療24天后，電針組收縮壓低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療30天后，電針組、空白組、模型組兩兩之間有顯著差異(P<0.01)，整體趨勢(shì)模型組收縮壓>電針組收縮壓>空白組收縮壓。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠治療前后收縮壓比較

注：與空白組比較，*P<0.01,**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01。

2.2 各組大鼠尿酸、尿素氮水平比較

兩兩比較，將模型組與空白組血清中尿酸、尿素氮含量相比，模型組明顯高于空白組，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；電針組和空白組相比，尿酸、尿素氮含量均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針組和模型組相比，電針組尿酸含量明顯下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，尿素氮含量也低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；總體結(jié)果顯示，各組大鼠尿酸、尿素氮含量從大到小趨勢(shì)依次是模型組>電針組>空白組。見(jiàn)表2、圖1～2。

2.3 各組大鼠腎臟ACE2、Ang(1-7)、AngⅡ、Ang(1-7)/AngⅡ表達(dá)水平比較

與空白組相比，模型組腎臟ACE2、Ang(1-7)、Ang(1-7)/AngⅡ的表達(dá)明顯降低，AngⅡ表達(dá)明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；經(jīng)過(guò)電針治療后，電針組和模型組相比，腎臟ACE2表達(dá)有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ang(1-7)、Ang(1-7)/AngⅡ表達(dá)明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),AngⅡ的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針組和空白組相比，ACE2的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表3、圖3。

注：1.空白組；2.電針組；3.模型組。圖1 各組大鼠尿酸水平的比較(μmmol/L)

注：1.空白組；2.電針組；3.模型組。圖2 各組大鼠尿素氮水平的比較(μmmol/L)

組別n尿素(μmmol·l-1)尿素氮(μmmol·l-1)空白組660.56±15.977.30±0.71電針組6108.29±6.09?△9.53±0.43?&模型組6148.74±37.43#11.60±0.41#

注：與空白組比較，#P<0.01，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.01，&P<0.05。

2.4 各組大鼠腎臟病理變化比較

HE染色結(jié)果顯示,空白組腎小球結(jié)構(gòu)完整，球囊比例正常，腎小管排列緊密，間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠腎小球囊腔擴(kuò)張，腎小球萎縮變小，腎小管排列紊亂，上皮細(xì)胞空泡樣變；電針組和模型組相比，腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張，腎小囊擴(kuò)張減輕，腎小管排列基本正常。Masson染色結(jié)果顯示，電針組較模型組膠原纖維堆積程度減輕。電鏡下觀察空白組腎足細(xì)胞足突排列規(guī)則，各細(xì)胞器形態(tài)正常；模型組大鼠腎足細(xì)胞足突形態(tài)和排列不規(guī)則，融合明顯，線粒體腫脹，有明顯線粒體空泡現(xiàn)象；電針組和模型組相比，腎足細(xì)胞足突形態(tài)基本正常，融合程度減輕，線粒體腫脹現(xiàn)象不明顯。見(jiàn)封三彩圖4和圖5。

表3 大鼠腎臟ACE2、Ang(1-7)、AngⅡ、Ang(1-7)/AngⅡ水平比較

注：與空白組比較，*P<0. 01,**P>0.05；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0. 01。

注：1.空白組；2.電針組；3.模型組。圖3 電針“太沖”“百會(huì)”對(duì)SHR大鼠腎臟ACE2表達(dá)的影響

圖5 電鏡觀察各組大鼠腎臟病理變化

3 討論

我國(guó)是腎病的高發(fā)國(guó)家，其中由高血壓引起的終末期腎病占了很大一部分比例，因此對(duì)高血壓早期腎損害的干預(yù)防范顯得尤為必要?，F(xiàn)代研究及臨床治療時(shí)發(fā)現(xiàn)針刺可以對(duì)早期腎損害有一定的預(yù)防和治療效果[12]。對(duì)于高血壓腎病的預(yù)防和治療，關(guān)鍵還是對(duì)病因的治療，即對(duì)高血壓的治療。《內(nèi)經(jīng)》提出：“陽(yáng)氣者，大怒則形氣絕，而血菀于上，使人薄厥”，臨床上高血壓早期發(fā)生的過(guò)程中，患者也多有急躁易怒，面紅色赤等氣血上逆的表現(xiàn)。因此臨床治療早期高血壓時(shí)，也多選用從肝論治。“太沖穴”作為肝經(jīng)的原穴，可以通過(guò)針刺直接對(duì)肝氣進(jìn)行調(diào)節(jié)，劉海華等[13]通過(guò)整理文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),太沖是治療高血壓的高頻穴位，治療效果肯定。實(shí)驗(yàn)所選用的另一個(gè)穴位“百會(huì)”，位于人體最高處，是督脈的要穴，也是手足三陽(yáng)、督脈及足厥陰之會(huì)。一方面與肝經(jīng)相連，可直瀉肝氣、平肝潛陽(yáng)，使血壓隨著氣血的平復(fù)逐漸恢復(fù)，另一方面，高血壓的發(fā)生發(fā)展，其本質(zhì)上是清陽(yáng)不升、濁陰不降、陰陽(yáng)失衡所造成的，而百會(huì)穴恰是升清降濁、開(kāi)竅醒神、平衡陰陽(yáng)的要穴。有研究發(fā)現(xiàn)百會(huì)穴確實(shí)對(duì)自發(fā)性高血壓有一定的治療效果[14-15]。“太沖穴”和“百會(huì)穴”一個(gè)在腳，一個(gè)在頭，一上一下，共同起到調(diào)整氣血平衡陰陽(yáng)的功效。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)電針“太沖”“百會(huì)”治療24天時(shí)，SHR大鼠的收縮壓已經(jīng)有一定程度的下降，30天治療結(jié)束后，SHR血清中尿酸、尿素氮等早期腎損害指標(biāo)有一定程度的降低；腎臟病理結(jié)果顯示，電針組的腎臟損害程度較模型組有明顯緩解，這說(shuō)明電針“太沖”“百會(huì)”確實(shí)可以對(duì)早期高血壓腎病有治療和預(yù)防作用。

前期的一些實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),針刺可以降低AngⅡ的表達(dá)，AngⅡ是RAS系統(tǒng)中重要的收縮血管物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)高血壓對(duì)腎臟的早期損害，主要是由血壓的升高逐漸引起的腎小動(dòng)脈硬化病變[16]，即主要體現(xiàn)在對(duì)血管上損害。RAS系統(tǒng)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)血管收縮的主要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)[17-18],AngⅡ的含量與血管狀態(tài)關(guān)系密切，AngⅡ含量的增高常會(huì)伴隨腎小球硬化的發(fā)生，且AngⅡ的含量越高，腎纖維化的程度越高。ACE2一方面可以分解AngⅡ，減輕AngⅡ?qū)ρ艿氖湛s和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，同時(shí)還促進(jìn)NO的釋放，發(fā)揮其擴(kuò)血管、抗氧化應(yīng)激及抗炎癥功效，另一方面也可以競(jìng)爭(zhēng)性地作用于AngⅠ,使之催化產(chǎn)生Ang(1-9),同時(shí)ACE2還可以下調(diào)AngⅡ受體1,削弱AT1R介導(dǎo)的病理性反應(yīng)，另外還可降低醛固酮釋放，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用[19-20]。Ang(1-7)主要對(duì)血管起到舒張作用，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用，Ang(1-7)/AngⅡ可能是反應(yīng)血管收縮狀態(tài)的重要指標(biāo)，高血壓引起的腎血管硬化可能和Ang(1-7)/AngⅡ的失衡有關(guān)。但針刺能否調(diào)節(jié)RAS系統(tǒng)中的舒血管因子的釋放，從而對(duì)血壓產(chǎn)生影響目前仍不清楚。

基于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探究針刺對(duì)腎RAS系統(tǒng)中舒血管通路的影響，進(jìn)而探討其對(duì)SHR大鼠腎損害的保護(hù)機(jī)制。此次結(jié)果顯示，電針“太沖”“百會(huì)”可以使SHR大鼠腎臟ACE2、Ang1-7的表達(dá)有所增加，AngⅡ的表達(dá)有所下降，Ang1-7/AngⅡ比值增加。說(shuō)明電針“太沖”“百會(huì)”可以促進(jìn)SHR大鼠腎臟ACE2、Ang1-7的表達(dá)，同時(shí)抑制AngⅡ的表達(dá)，改善內(nèi)皮功能和血管彈性，引起血管舒張，使血壓降低，從而對(duì)自發(fā)性高血壓早期腎損害有保護(hù)作用。