鼠尾懸吊法小鼠抑郁模型的評價(jià)及其對下丘腦-腺垂體-甲狀腺軸的影響

呂子成 趙富浩 陳力僑 王秋雨 王錚 劉孟琦 林來祥

1天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 300070； 2國家衛(wèi)生健康委員會激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津醫(yī)科大學(xué))，天津市代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所 300070

抑郁癥是一種以心境低落為主要特征的顯著而持久的心理障礙，其病因復(fù)雜且發(fā)病率逐年升高，目前全球約有15%的人或多或少地受到抑郁癥的影響，預(yù)計(jì)至2020年，抑郁癥將成為全球造成殘疾的第二大疾病[1-2]。研究表明，抑郁癥的發(fā)生與慢性應(yīng)激密切相關(guān)，慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激模型是目前應(yīng)用最廣泛的抑郁癥動物模型，但此模型實(shí)際操作過程的工作量較大，持續(xù)時(shí)間較長[3]。鼠尾懸吊法最早用于航天醫(yī)學(xué)中骨質(zhì)疏松模型的研究，后來發(fā)現(xiàn)，長期鼠尾懸吊作為一種持續(xù)的、中低水平的慢性應(yīng)激，對免疫功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能等都有影響[4-6]。亦有研究表明該模型可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)抑郁癥樣行為[7]。然而，目前相關(guān)的研究仍然較少。甲狀腺激素在機(jī)體新陳代謝、生長發(fā)育和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的興奮性等方面具有重要作用。大量臨床研究表明，抑郁癥與下丘腦-腺垂體-甲狀腺軸(HPT軸)功能異常密切相關(guān)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，甲狀腺功能減退癥是抑郁癥的重要危險(xiǎn)因素，抑郁癥患者亦常合并甲狀腺功能減退癥。然而，亦有研究表明，抑郁癥患者可有輕度的甲狀腺功能亢進(jìn)癥，且對于抑郁癥和HPT軸功能異常之間的因果關(guān)系和具體的作用機(jī)制，目前尚存在較大爭議[8-11]。相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)也進(jìn)行的較少。本研究通過鼠尾懸吊法建立動物模型，根據(jù)動物行為學(xué)和下丘腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，評價(jià)該抑郁癥模型是否有效，并通過病理形態(tài)學(xué)和血清激素水平，探討該模型對HPT軸功能的影響，為相關(guān)疾病的防治以及臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 健康昆明小鼠30只,購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK-(軍)2012-0004，雌、雄各半，體重(26±2)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、懸吊14 d組、懸吊28 d組，每組雌鼠、雄鼠各5只，12 h光照、12 h黑暗，自由飲食、飲水。按照文獻(xiàn)所述方法建立動物模型[12]?？瞻讓φ战M正常飼養(yǎng)，懸吊14 d組正常飼養(yǎng)14 d后進(jìn)行鼠尾懸吊，懸吊28 d組分組后立刻進(jìn)行鼠尾懸吊。定期觀察各組行為、反應(yīng)能力，進(jìn)食及皮毛光澤等方面的差異。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[13]所述方法，于實(shí)驗(yàn)28 d后，將各組小鼠放入水缸(2 000 ml燒杯, 高20 cm，直徑14 cm，水深10 cm)中，調(diào)節(jié)水溫23℃～ 25℃，每缸一只，置水中觀察6 min，記錄各小鼠后4 min內(nèi)累計(jì)不動時(shí)間。

1.2.2 下丘腦5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)含量和單胺氧化酶(MAO)活力的測定 各組小鼠于實(shí)驗(yàn)開始28 d后處死，立刻在冰上打開顱骨，剝離下丘腦，于-80℃保存，稱重，按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下制備10%的勻漿，2 500 r/min(r=11 cm)離心，取上清液，棄去取組織過少的樣本，每組均保留8個樣本。采用雙縮脲法測定蛋白含量(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)，采用ELISA法測定5-HT、NE含量(試劑盒購自北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)，采用紫外分光光度法測定MAO活力(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)，并用蛋白含量校正5-HT、NE含量和MAO活力。

1.2.3 血清FT3、FT4、促甲狀腺激素(TSH)濃度的測定 各組小鼠股動脈放血后，收集血液，靜置40 min，離心取上清液，棄去取血過少的樣本，每組均保留8個樣本，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定血清FT3、FT4濃度(試劑盒購自德國西門子公司)，采用ELISA法測定血清TSH濃度(試劑盒購自北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.2.4 甲狀腺、垂體的形態(tài)學(xué)觀察 各組小鼠處死后迅速取出甲狀腺、垂體、海馬，固定后石蠟包埋，常規(guī)切片，采用HE染色后于光鏡下觀察甲狀腺、海馬，采用三色染色后于光鏡下觀察垂體[14]。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài) 懸吊14 d組和懸吊28 d組在干預(yù)初期易激惹，常出現(xiàn)尖叫，隨著懸吊時(shí)間延長，出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍的表現(xiàn)，皮毛光澤差，進(jìn)食量減少，體重增長減慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組活動減少，常蜷縮成團(tuán)。實(shí)驗(yàn)過程中懸吊28 d組1只雌性小鼠死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組小鼠體重均顯著低于空白對照組，各組實(shí)驗(yàn)前、后體重見表1。

2.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 與空白對照組相比，懸吊14 d組和懸吊28 d組強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)累計(jì)不動時(shí)間均顯著延長(P<0.01)，見表2。

2.3 下丘腦5-HT、NE含量和MAO活力 與空白對照組相比，懸吊14 d組下丘腦內(nèi)5-HT和NE含量顯著降低(P均<0.05)，MAO活力有增高趨勢；懸吊28 d組下丘腦5-HT和NE含量顯著降低(P均<0.05)，且5-HT降低幅度比懸吊14 d組更明顯，MAO活力顯著增加(P<0.05)，見表3。

2.4 血清FT3、FT4、TSH水平 與空白對照組相比，懸吊14 d組和懸吊28 d組血清FT4水平顯著降低(P<0.01)，且懸吊28 d組降低幅度更大，空白對照組、懸吊14 d組、懸吊28 d組血清TSH濃度有依次升高趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組血清FT3水平無明顯變化，見表4。

2.5 甲狀腺、垂體病理形態(tài)變化 正常甲狀腺實(shí)質(zhì)內(nèi)為圓形或類圓形的甲狀腺濾泡，濾泡壁由單層立方上皮圍成，腔內(nèi)含有紅色膠狀物，濾泡上皮細(xì)胞的形態(tài)可隨機(jī)能狀況而改變，呈立方形、矮柱狀或高柱狀，濾泡間為少量間質(zhì)。與空白對照組相比，懸吊14 d組甲狀腺沒有明顯變化，懸吊28 d組可見甲狀腺濾泡明顯大小不均、形狀各異，大濾泡上皮細(xì)胞變扁平，見圖1(封3)。各組垂體組織無明顯變化。

3 討論

研究表明，應(yīng)激可以激活下丘腦-腺垂體-腎上腺軸，使得機(jī)體適應(yīng)應(yīng)激狀態(tài)，但長期處于不可逃避的應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，由于下丘腦-腺垂體-腎上腺軸的持續(xù)性興奮，可嚴(yán)重影響身心健康，從而出現(xiàn)抑郁癥狀，這是目前比較公認(rèn)的慢性應(yīng)激引起抑郁癥的機(jī)制之一。鼠尾懸吊法通過長期給予動物慢性的刺激，使之長期處于慢性應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而造成一系列神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的病理生理變化和情感障礙，從而建立抑郁癥動物模型。陳怡西等[7]研究發(fā)現(xiàn)，懸吊14 d的大鼠可出現(xiàn)血清皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素水平升高，并出現(xiàn)空場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動減少等抑郁癥樣行為。本研究中，懸吊14 d組和懸吊28 d組出現(xiàn)了強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)累計(jì)不動時(shí)間延長，一定程度上揭示了小鼠在無法逃避的持續(xù)刺激下產(chǎn)生了絕望情緒，也從動物行為學(xué)的角度證明了該模型的有效性[3]。研究表明，各種原因引起的下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT、多巴胺、NE的含量減少，與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激模型大鼠下丘腦5-HT含量明顯減少，且經(jīng)過有效的抗抑郁癥治療后，抑郁癥大鼠下丘腦5-HT含量可以恢復(fù)[15]。MAO能夠分解單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，抑制MAO的藥物已經(jīng)成為臨床上應(yīng)用的經(jīng)典抗抑郁癥藥物[16]。本研究中，懸吊14 d組和懸吊28 d組小鼠出現(xiàn)了不同程度的下丘腦5-HT和NE含量減少以及MAO活力增加，這可能是模型組小鼠抑郁樣行為出現(xiàn)的原因之一。

表1 空白對照組、懸吊14 d組、懸吊28 d組實(shí)驗(yàn)前后體重比較

注：與空白對照組相比，aP<0.01

表2 空白對照組、懸吊14 d組、懸吊28 d組累計(jì)不動時(shí)間比較

注：與空白對照組相比，aP<0.01

表3 空白對照組、懸吊14 d組、懸吊28 d組下丘腦5-HT、NE含量和MAO活力比較

注：NE：去甲腎上腺素；5-HT：5-羥色胺；與空白對照組相比，aP<0.05

表4 空白對照組、懸吊14 d組、懸吊28 d組血清甲狀腺激素水平比較

注：TSH：促甲狀腺激素；與空白對照組相比，aP<0.01，bP<0.05

懸吊14 d和懸吊28 d的小鼠，在動物行為學(xué)和下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量等方面，均出現(xiàn)了與經(jīng)典的抑郁癥動物模型相似的變化。鼠尾懸吊法建立抑郁模型簡單有效，對抑郁癥的機(jī)制和診療方式的進(jìn)一步研究具有一定的意義。

甲狀腺激素不僅對機(jī)體新陳代謝和生長發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，亦是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性的重要物質(zhì)，與情感、精神、記憶等功能密切相關(guān)。大量的研究表明，臨床上抑郁癥患者常合并甲狀腺功能異常，較多報(bào)道顯示抑郁癥患者，尤其是女性和老年人，易存在血清FT3、FT4水平降低和TSH水平升高[8]。甲狀腺功能的篩查可以作為抑郁癥患者的常規(guī)評估，然而，也有部分研究者認(rèn)為，抑郁癥患者存在血清FT4水平升高和TSH水平降低，抗抑郁癥治療后血清FT4水平則有所下降[9-10]。關(guān)于抑郁癥對HPT軸功能影響的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)壳拜^少，且結(jié)論亦存在類似的爭議。有研究認(rèn)為，慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型使得大鼠血清T3和T4水平降低以及TSH水平升高[17]。也有研究者用完全相同的模型得出了相反的結(jié)論，即抑郁癥大鼠血清T3和T4水平升高以及TSH水平降低，且抗抑郁癥治療可使這些異常的指標(biāo)不同程度地恢復(fù)正常[18-19]。

本研究中采用鼠尾懸吊法建立抑郁癥模型，懸吊14 d組出現(xiàn)了抑郁癥樣行為和下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的減少，與此同時(shí)，小鼠的甲狀腺功能也發(fā)生了變化，表現(xiàn)為血清FT4水平降低和TSH水平升高，懸吊28 d組下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和血清FT4、TSH的變化則更加明顯，同時(shí)，小鼠的甲狀腺組織出現(xiàn)了光鏡下可見的病理變化。懸吊28 d組的甲狀腺濾泡大小不均勻，較大濾泡的上皮細(xì)胞變扁平，提示甲狀腺功能減退，新生的較小的濾泡增多體現(xiàn)了在TSH作用下甲狀腺功能的代償。血清甲狀腺激素水平受垂體TSH的調(diào)節(jié)，TSH可促進(jìn)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生以及合成和釋放甲狀腺激素，甲狀腺激素又可以作用于垂體，抑制細(xì)胞分泌TSH。因而臨床上甲狀腺功能減退癥患者除了血清甲狀腺激素水平降低之外，還有TSH水平的升高。本研究中，懸吊14 d組和懸吊28 d組均出現(xiàn)了上述變化，與臨床上伴有甲狀腺功能減退癥的抑郁癥患者較為一致。而與空白對照組相比，懸吊14 d組和懸吊28 d組血清FT3水平并沒有明顯變化，可能是由于脫碘酶的活力增強(qiáng)，代償性增加T4向T3轉(zhuǎn)化的結(jié)果。

抑郁癥與HPT軸功能紊亂之間的關(guān)系和相互作用機(jī)制十分復(fù)雜。研究表明，5-HT可抑制TSH釋放激素的分泌[18]。抑郁模型小鼠下丘腦5-HT水平降低，可以通過增加TSH釋放激素的分泌，引起TSH水平升高，該機(jī)制可能參與了抑郁癥時(shí)甲狀腺功能減退的代償。值得關(guān)注的是，HPT軸功能紊亂不僅是抑郁癥的一種合并癥，其本身亦參與了抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展。動物實(shí)驗(yàn)證明，注射T3能夠提高大鼠5-HT水平，甲狀腺功能減退癥會造成5-HT的分泌減少，并且會通過改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)5-HT受體的敏感性，抑制由5-HT介導(dǎo)的神經(jīng)元之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]。因而，甲狀腺功能減退癥或許通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)5-HT的含量和功能，促進(jìn)抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展，形成一種惡性循環(huán)。本研究中，懸吊14 d組下丘腦內(nèi)MAO活力僅出現(xiàn)增加趨勢時(shí)，其5-HT水平已經(jīng)出現(xiàn)了顯著降低，提示可能存在獨(dú)立于MAO活力變化的其他機(jī)制，造成5-HT的減少，或許與T4的減少有關(guān)。

綜上所述，鼠尾懸吊法建立小鼠的抑郁模型有效，且該模型可造成HPT軸功能紊亂，表現(xiàn)為小鼠HPT軸功能降低，但尚可通過增加T4向T3的轉(zhuǎn)化而代償，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。