基于ITS2條形碼對龍虎山野生石斛資源的研究

宋劍波,周松松,楊 坤,曽黎明,王勝難,王國鑫,何 彬,王義華,黃長干*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學理學院,江西南昌 330045；2.江西軒斛生物科技有限公司,江西鷹潭 335005)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是蘭科石斛屬,為多年生的草本植物,是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材之一,在我國已經(jīng)有兩千多年的藥用歷史,具有養(yǎng)陰生津、益胃、抗腫瘤、抗突變、降血糖的功效,被譽為“中華九大仙草之首”[1-2]。野生鐵皮石斛生長于海拔100～3 000 m的山地半陰濕巖石、樹皮上,喜溫暖濕潤氣候和半陰濕的環(huán)境,不耐寒。鐵皮石斛種子細小,其種子在自然條件下需與合適的真菌共生才能萌發(fā),因而自身繁殖能力極低。再加上人類對其生境的破壞和資源的過度利用,使野生鐵皮石斛資源瀕臨滅絕,成為“瀕危珍稀植物”,被列到《中國植物紅皮書》[3-5]?，F(xiàn)有栽培鐵皮石斛的地區(qū)也從傳統(tǒng)的浙江、云南擴展到廣西、廣東、福建、安徽、貴州、江蘇、北京、上海等10余個省市區(qū)[6]。在江西,石斛產(chǎn)業(yè)還處于起步階段,目前只在鷹潭、上饒、贛州、撫州等地有一定規(guī)模的種植。野生鐵皮石斛資源豐富,氣候生態(tài)環(huán)境適合鐵皮石斛規(guī)模化種植。

近年來,在國際上發(fā)展起來一種新的生物鑒定技術——DNA條形碼技術，此技術主要是利用一段有足夠變異的、易擴增且相對較短的標準的DNA序列提供快速、準確的分子水平上的鑒定[7-8]。這項技術起源于 “生命條形碼計劃”(barcode of life project),“生命條形碼計劃”于2003年由加拿大安大略省圭爾夫(http://www.barcoding.si.edu)的研究人員發(fā)起,旨在建立一個基于標準分子方法的真核物種清單的通用系統(tǒng)，并于2004年由國際生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)發(fā)起[9]。只要有準確的分類學鑒定,就可以建立一個公共的分類群參考數(shù)據(jù)庫,以此來鑒定更廣泛的物種。DNA條形碼可以為許多科學領域(如生態(tài)學、生物醫(yī)學、流行病學、進化生物學、生物地理學和保護生物學)和生物工業(yè)提供有力的支持。DNA條形碼的成本和時間效益使其能夠自動識別物種。這在大型取樣活動中特別有用,例如Craig Venter的全球海洋取樣小組的大規(guī)模采樣鑒定[10]。通過這種方式，DNA條形碼還可以改進針對具有醫(yī)學、生態(tài)和農(nóng)學意義的病原物種的未知物種檢測和鑒定的大型調(diào)查[11]。此外,重要的是能夠識別、檢測和追蹤專利生物在農(nóng)業(yè)生物技術中的擴散,以證實來源生物或生物資源的安全知識產(chǎn)權[12-14]。

目前植物DNA條形碼主要根據(jù)國際生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)的建議,在植物葉綠體中尋找植物 DNA 條形碼[15]。ITS序列可以作為種子植物的核心條形碼,用于植物的分類鑒定[16]。DNA條形碼將DNA的標準區(qū)域作為物種識別的工具進行測序,截至目前,在植物中還沒有形成統(tǒng)一的DNA條形碼通用序列,其物種水平的鑒定效率達92.7%。目前核基因ITS2片段是公認的具有相對優(yōu)勢的片段而被關注[17-23]。近幾年國內(nèi)中藥 DNA 條形碼分子鑒定得到快速發(fā)展,加快了中藥鑒定標準化的進程。通過中藥DNA條形碼鑒定研究,我國首次提出將 ITS2序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列,并建立以ITS2為核心、psb A-trn H為補充序列的植物類藥材DNA條形碼鑒定體系和以COI序列為核心、ITS2為輔助序列的動物類藥材DNA條形碼鑒定體系,為中藥DNA條形碼鑒定的發(fā)展奠定了堅實基礎[24]。ITS2片段在植物物種水平上變化速度相對而言比較快,有更多的突變位點來區(qū)別不同品種之間的微小差別,因此在品種的鑒定上具有很大的潛在價值。筆者利用ITS2序列對龍虎山鐵皮石斛31個樣品進行了分類和鑒定,以期為保護江西優(yōu)質(zhì)的石斛資源奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料試驗樣本為江西省鷹潭市龍虎山石斛野生種質(zhì)資源。根據(jù)外型不同采取野生石斛樣品31個(表1)。

表1 石斛樣品編號

1.2儀器與試劑儀器：DYY-5電泳儀(北京六一儀器廠)；HC-2518R離心機(加拿大BBI公司)；FR980凝膠成像系統(tǒng)(上海復日科技儀器有限公司)；S1000PCR儀(美國伯樂BIO-RAD)；旋渦混勻器(美國LABNET)；測序儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)；移液槍(北京DRAGONMED)。

試劑：植物基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)； ExTaq酶(TaKaRa寶日醫(yī)生物技術有限公司)；瓊脂糖(BIOWEST ,西班牙)；引物交由上海生工生物公司合成,75%乙醇,液氮。

1.3方法采用植物基因組DNA提取試劑盒對31個樣品進行DNA提取,所有基因組DNA樣品采用ITS2通用引物進行PCR擴增,并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.1總DNA的提取。

(1)取新鮮鐵皮石斛樣品的葉片100 mg左右放入研缽,加入液氮,快速充分碾磨成細粉,之后利用植物基因組DNA提取試劑盒。

(2)把細粉轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中,加入550 μL 65 ℃預熱的Buffer P1和4 μL RNase A,劇烈渦旋1 min,靜置10 min。

(3)加入130 μL Buffer P2混勻,1 200 r/min離心3 min,吸取上清液于分離柱A,12 000 r/min離心3 min,收集濾液加入1.5倍體積的Buffer P3輕輕渦旋。

(4)將上述液體加入一個吸附柱AC中,12 000 r/min離心1 min,棄廢液。

(5)加入700 μL漂洗液WB,12 000 r/min離心1 min,棄廢液。

(6)將吸附柱AC放回空收集管中,12 000 r/min,5 min,盡量去除漂洗液。

(7)將吸附柱AC放于干凈的離心管中,在吸附膜中間加入25 μL洗脫緩沖液EB(先放于65 ℃水浴中預熱使用)；室溫放置3～5 min,12 000 r/min離心1 min,再加入25 μL洗脫緩沖液,放置3～5 min,12 000 r/min離心1 min,收集DNA。

(8)收集的DNA可存放于2～8 ℃,長期保存則放于-20 ℃。用 0.8%的瓊脂糖進行電泳檢測,并經(jīng)UItraPowerDNA染料染色后,在凝膠成像系統(tǒng)上觀測其純度并判斷DNA分子的大小及完整性,選取條帶單一、清晰明亮的基因組用于下一步試驗。

1.3.2序列擴增與測定。PCR反應體系為模板DNA 1 μL、ExTaq酶 10 μL、引物A(P1) 1 μL、引物S(P2) 1 μL、滅菌水 7 μL。

正反序列引物分別為P1：CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC；P2：TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG。

PCR擴增程序為94 ℃高溫預變性5 min；94 ℃模板變性30 s,54 ℃復性30 s,72 ℃延伸45 s,共計35個循環(huán)。直接測序PCR擴增純化,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,進行ITS2序列的測序工作,送到上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序。

1.3.3數(shù)據(jù)處理。通過DNA條形碼技術對在龍虎山采取的31株野生石斛樣品進行分子鑒定,之后在NCBI上進行樣品BLAST同源性比對分析。采用序列拼接軟件Codon Code Aligner V3.0對測序峰圖進行校正,去除低質(zhì)量序列及引物區(qū),進行多序列比對和人工校驗。然后使用基于隱馬爾可夫模型[25-28](hidden Markov model,HMMer)去除所有序列兩端的5.8S和26S區(qū)段,進而獲得ITS2間隔序列。將所得DOKM-1、DOKM-2、DOKM-4、DOKM-5、DOKM-12、DOKM-13、DOKM-19、DOKM-21、DOKM-24、DOKM-26號的數(shù)據(jù)在Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)網(wǎng)站上進行樣品間的兩兩同源性比對。之后將這10個樣品數(shù)據(jù)導入生物信息學軟件MEGA 7.0進行多序列比對,并使用同種軟件計算K2P遺傳距離,測定樣品之間親緣關系,用軟件MEGA 7.0對所得序列構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1樣品間的兩兩同源比對從31株樣品中鑒定出10個品種,挑選10個品種的樣品進行兩兩同源性比對，結(jié)果表明,品種十與其他品種同源差異最大,其他品種間雖有差異,但變化極小(表2)。

表2 10個品種之間的兩兩同源比對

2.2野生石斛分子鑒定通過DNA條形碼技術對在龍虎山采取的31株野生石斛樣品進行分子鑒定,之后在NCBI上進行樣品BLAST同源性比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn),這31株樣本分別屬于10個品種。其中,有9個品種為鐵皮石斛,1個品種為霍山石斛。在9個鐵皮石斛品種中,有6個龍虎山特有的鐵皮石斛品種,其中DOKM-1、DOKM-3、DOKM-12、DOKM-21、DOKM-19、DOKM-4和DOKM-26為龍虎山特有種,其生長形態(tài)如圖1(選自江西龍虎山江西龍虎天元生物科技有限公司)所示。

注：A.DOKM-1；B.DOKM-3；C.DOKM-21；D.DOKM-19；E.DOKM-12；F.DOKM-26圖 1 龍虎山鐵皮石斛特有品種 Fig.1 Specific varieties in Longhu Mountain

其中,品種一、品種二、品種三、品種四、品種五和品種六都屬于龍虎山特有的野生鐵皮石斛品種(表3)。將這6個品種在NCBI上進行登記認證,其GenBank序列號見表4。對其ITS2序列進行分析后,發(fā)現(xiàn)龍虎山特有的鐵皮石斛品種的序列長度為597～601 bp,ITS序列的GC含量為52.91%～53.27%,平均GC含量約為53.04%。

表3 龍虎山石斛種質(zhì)鑒定

將鑒定出10個品種的基因序列使用MEGA6.0計算K2P遺傳距離,結(jié)果表明,其種內(nèi)的遺傳距離在0～0.005(表5)。由此可知,龍虎山特有品種的鐵皮石斛之間序列進化變異極小。

2.3系統(tǒng)發(fā)育樹分析使用MEGA 6.0 軟件對31株樣品的測序結(jié)果進行分析并建立DNA條形碼的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，結(jié)果表明,31株龍虎山野生石斛樣品有30株為鐵皮石斛,1株為霍山石斛,分屬于10個品種,其中6個是龍虎山特有品種。它們之間有差異,但變異程度極小,都是由同一分支進化而來。

表4 6種特有品種ITS2間隔區(qū)的基本信息

表5 10個品種之間的K2P遺傳距離

圖 2 31株樣品之間的進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of the thirty-one sample

3 討論與展望

DNA條形碼技術是指使用通用DNA序列信息鑒定物種變異類型的一種分子生物學技術。在物種鑒別中,有很多可用的方法,可以是從形態(tài)方面的鑒別,也可以是從分子水平上的檢測。因從形態(tài)學上的方法區(qū)別近屬物種難度比較大,所以一般選用從分子水平來進行檢測。雖然DNA分子在進化了數(shù)億萬年之后,種屬之間差異很大,但對于同一物種而言,DNA條形碼技術在物種變異過程的鑒定中具有很大的作用。

該研究利用DNA條形碼技術對龍虎山地區(qū)的野生石斛資源進行了分子遺傳學鑒定,進行分門別類,并結(jié)合江西其他地區(qū)已知的野生石斛建立江西地區(qū)野生石斛種質(zhì)資源庫,以保護江西優(yōu)質(zhì)的石斛資源。鷹潭龍虎山是我國鐵皮石斛資源主要分布區(qū)之一,野生鐵皮石斛資源豐富,氣候生態(tài)環(huán)境適合鐵皮石斛規(guī)模化種植。目前,龍虎山鐵皮石斛基地已經(jīng)建立穩(wěn)定有效的龍虎山石斛新品種的組培快繁體系和栽培技術體系,一方面可以保護龍虎山的野生種質(zhì)資源,另一方面可以對新品種進行大規(guī)模的人工栽培與開發(fā),還可以對比龍虎山石斛與其他地區(qū)石斛的營養(yǎng)成分差別,最終篩選出優(yōu)質(zhì)的石斛新品種并進行推廣。