草甘膦對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的影響

劉阿梅，林 姿，徐 曼，趙子慧，楊姍姍，陳培超

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江溫州 325035)

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的飛速發(fā)展，農(nóng)藥的使用越來越廣泛，它們對植物、動物和人類的危害越來越嚴(yán)重。一方面，它們可以直接進(jìn)入生物體內(nèi)，引起急性、慢性中毒和畸變，另一方面，通過徑流、排污、揮發(fā)等途徑進(jìn)入土壤、大氣和水體，引起各種生態(tài)環(huán)境下生物的死亡，并通過食物鏈的富集傳遞，影響人類食品安全[1-2]。

草甘膦(GPS)為廣譜性有機(jī)磷除草劑，是世界上應(yīng)用最廣、用量最大的農(nóng)藥品種[3-5]，隨著對“抗草甘膦”作物的不斷研究與種植，草甘膦的使用量必然不斷增加。據(jù)預(yù)測，未來幾年草甘膦的需求量將保持15%的增速，草甘膦對人類健康和生態(tài)毒性的潛在威脅日益凸顯。有研究發(fā)現(xiàn)草甘膦對水生環(huán)境有潛在的威脅[6]。Relyea[7]指出使用草甘膦會造成蝌蚪大量死亡。草甘膦制劑(roundup)對金魚的急性毒性(carassius auratus)的相關(guān)研究表明，草甘膦制劑與金魚細(xì)胞的微核率、細(xì)胞核核異常及鏈斷裂損傷等存在明顯的濃度劑量效應(yīng)關(guān)系[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，人在工作中接觸農(nóng)藥，包括接觸草甘膦為活性劑的農(nóng)達(dá)，即便通過孕婦配偶的男性接觸，也可能導(dǎo)致生育問題[10]。除此之外，孕前接觸草甘膦除草劑提高而后流產(chǎn)的風(fēng)險，孕后接觸草甘膦除草劑通常與晚期自然流產(chǎn)相關(guān)。另外，注射服用草甘膦后，觀察到血液、肝臟與睪丸中氧化應(yīng)激狀態(tài)衰變，可能與繁殖性毒性關(guān)聯(lián)[11]。而關(guān)于草甘膦是否會影響胚胎發(fā)育及其機(jī)制、早期胚胎對草甘膦的敏感濃度，卻未見有詳細(xì)報道，草甘膦的生態(tài)風(fēng)險尚待揭示[12]。因此，我們利用熱帶爪蟾作為模式生物，研究草甘膦對早期胚胎發(fā)育的影響機(jī)制，熱帶蟲蟾因其個體小、生長周期短，胚胎發(fā)育模式與人類相近，而且其基因組簡單更適合作為模式生物用于人類基因的研究[13-14]。用不同濃度梯度的草甘膦處理熱帶爪蟾囊胚期的胚胎，通過檢測胚胎死亡率、畸形率評價草甘膦對早期胚胎的發(fā)育毒性效應(yīng)。同時，這些研究也將為環(huán)境評估中草甘膦安全濃度的設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1主要試劑。草甘膦(damas-beta)、人絨毛膜促性腺激素(HCG，寧波第二激素廠)、L-半胱氨酸以及二甲基亞砜(生工生物工程有限公司)、Nikon SMZ 1000 體視顯微鏡。0.1×MMR(0.1 mol/L NaCl、2.0 mmol/L KCl、1 mmol/L MgSO4、2 mmol/L CaCl2、5 mmol/L HEPES、0.1 mmol/L EDTA)。

1.1.2試驗材料。 選自本實(shí)驗室培養(yǎng)的性成熟的熱帶爪蟾及其胚胎。

1.2試驗方法

1.2.1胚胎的獲取。選取本實(shí)驗室飼養(yǎng)的雌雄熱帶爪蟾多對，采用人工注射HCG的方法進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)卵，用2%半胱氨酸溶液去除卵外膠質(zhì)膜，待發(fā)育到囊胚末期、原腸胚前期(stage9～10)，對正常的胚胎進(jìn)行染毒試驗[15]。

1.2.2胚胎的暴露試驗(FETAX)。根據(jù)查閱資料及前期預(yù)試驗，將草甘膦用二甲基亞砜(DMSO)溶解后稀釋成0、10-5、10-4、10-3mol/L 4個濃度，用0.1×MMR稀釋成相應(yīng)的濃度梯度，為了減少試驗誤差以及避免受精過程的不確定性，在囊胚期于顯微鏡下挑選發(fā)育正常的熱帶爪蟾胚胎，并從囊胚期開始染毒至原腸期結(jié)束(約3 h)。用直徑10 cm的培養(yǎng)皿作為染毒試驗容器，加入50 mL草甘磷溶液， 150只stage 9～10發(fā)育良好的胚胎，每個濃度設(shè)置3個平行組，于恒溫培養(yǎng)箱(26±0.5)℃黑暗培養(yǎng)12 h，之后每24 h換一次液[14-15]。

1.2.3顯微觀察。每間隔6 h 記錄各濃度組胚胎死亡、畸形的情況，用體視顯微鏡觀察胚胎，并拍照和記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4數(shù)據(jù)處理。運(yùn)用Spass13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，采用 t 檢驗進(jìn)行比較，統(tǒng)計學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)為P< 0.05 (*),P< 0.01(**)。

2 結(jié)果與分析

2.1草甘膦處理熱帶爪蟾胚胎后形態(tài)觀察囊胚期與原腸胚時期是胚胎發(fā)育過程最關(guān)鍵的時期，在這2個時期，胚胎經(jīng)歷了三胚層的分化、細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞遷移等重要的生命過程，它是組織和器官原基形成的關(guān)鍵時期。假如，在這2個時期發(fā)育異常，將直接導(dǎo)致后期發(fā)育的正常進(jìn)程。因此，挑選囊胚期(stage7～8)發(fā)育正常的胚胎，并進(jìn)行不同梯度的草甘膦染毒試驗，到stage12(原腸胚末期)撤去草甘膦，并換上新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96 h。

當(dāng)囊胚期與原腸胚期的胚胎進(jìn)行草甘膦染毒處理后，爪蟾胚胎后期的發(fā)育受到不同程度的影響。胚胎在草甘膦處理后的毒性效應(yīng)下，表現(xiàn)出不同程度的畸形現(xiàn)象(圖1)。其中圖1(1～4)為原腸胚期的胚胎(stage12)，在草甘膦的作用下，此時期的胚胎表現(xiàn)出不同程度的發(fā)育遲緩(3～4)，尤其表現(xiàn)在胚孔背唇不能閉合。圖1(5～8)為神經(jīng)胚期胚胎(stage17)，由于前期原腸期草甘膦染毒的影響，出現(xiàn)胚孔無法閉合(圖1)，導(dǎo)致神經(jīng)胚時胚胎不能正常形成神經(jīng)板(6～8)。隨著發(fā)育進(jìn)程的繼續(xù)，爪蟾胚胎的畸形率和死亡率繼續(xù)在增加。在胚胎發(fā)育至尾牙期中期(stage31),圖1(9～12)表現(xiàn)出不同程度的腹方化與體節(jié)變短、斷尾、眼睛發(fā)育異常以及脊柱彎曲等畸形表型。隨著草甘膦毒性效應(yīng)的積累，在胚胎發(fā)育至尾牙晚期stage38，主要出現(xiàn)頭部異常、脊柱彎曲和軀體色素減少等發(fā)育異常的癥狀[圖1(13～16)]。當(dāng)胚胎發(fā)育至蝌蚪期時stage40～46[圖1(17～28)]，草甘膦的毒性效應(yīng)更為明顯，出現(xiàn)大量圍心腔水腫(18～19)，尾巴彎曲(19，22,26)，短尾和無尾，以及三角錐形大頭等嚴(yán)重的畸形特征的表型現(xiàn)象(22,23,24,27,28)，眼睛變小(18)，以及心臟發(fā)育異常(27,28)。

同時，我們對胚胎染毒后的24、48、72、96 h等4個階段胚胎的不同程度畸形進(jìn)行統(tǒng)計(圖2)，熱帶爪蟾的囊胚后期以及原腸胚期胚胎在受到草甘膦處理后，胚胎的正常發(fā)育的軌跡被擾亂，導(dǎo)致胚胎不同程度畸形，甚至死亡。主要表現(xiàn)發(fā)育遲緩、色素減少、脊柱和尾部彎曲、短尾和無尾、眼睛變小以及圍心腔水腫等。表明，草甘膦對熱帶爪蟾胚胎產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性效應(yīng)，嚴(yán)重影響胚胎發(fā)育正常進(jìn)行。

注：St12：stage12原腸胚期胚胎(1～4)：1，對照組正常胚胎；3～4.實(shí)驗組草甘膦處理后畸形胚胎；st17. stage17神經(jīng)胚期胚胎(5～8);5.對照組正常胚胎, 6～8.實(shí)驗組草甘膦處理后畸形胚胎；st31.stage31尾牙期中期胚胎，9.對照組正常胚胎，10～12.實(shí)驗組草甘膦處理后畸形胚胎；st38.stage38尾牙晚期胚胎(13～16);13.對照組正常胚胎;14～16.實(shí)驗組草甘膦處理后畸形胚胎； st40.stage40蝌蚪期早期(17～20);17.對照組正常胚胎;18～20.實(shí)驗組草甘膦處理后的畸形胚胎;st42.stage42蝌蚪期中期(21～24);21.對照組正常胚胎;22～24.實(shí)驗組草甘膦處理后的畸形胚胎后期胚胎；st46.stage46蝌蚪期后期(25～28);25.對照組正常胚胎;26～28.實(shí)驗組草甘膦處理后的畸形胚胎Note:St12.stage12 embryo at gastrula stage(1-4); 1.Normal fetus of control; 3-4. Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group ; st17.Stage17 embryo at the neurula stage(5-8);5.Normal fetus of control;6-8. Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group ;st31.stage31 embryo of middle tail period 9. Normal fetus of control;10-12. Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group .st38.stage38 embryo of late tail period (13-16);13.normal fetus of control;14-16.Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group ;st40.stage40 early tadpole period(17-20) ;17.Normal fetus of control;18-20.Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group ;st42.stage42 middle tadpole period (21-24) ;21.Normal fetus of control;22-24.Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group ;st46.stage46 late tadpole period(25-28);25.Normal fetus of control;26-28.Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group圖1 草甘膦對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的致畸效應(yīng)Fig.1 Teratogenic effects of glyphosate on embryonic development of Xenopus tropicalis

注：A、B、C、D分別為胚胎染毒結(jié)束后的stage31，stage38，stage40，stage46等四個時期胚胎不同畸形程度百分比統(tǒng)計(n>100)Note:A,B,C,and D are the percentages of different degrees of abnormality of embryos in stage 31,stage38,stage40,and stage46 after embryo exposure (n>100)圖2 不同濃度草甘膦對不同時期胚胎的畸形程度進(jìn)行統(tǒng)計Fig.2 Statistics on the degree of malformation of embryos at different stages by different concentrations of glyphosate

2.2不同濃度的草甘膦對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育畸形率和死亡率的影響為探究草甘膦對胚胎毒性效應(yīng)的劑量關(guān)系，草甘膦對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的總畸形率和死亡率的影響統(tǒng)計如圖3所示。由圖3可知，胚胎在10-3mol/L草甘膦藥物處理組的畸形率與對照組呈顯著差異(P<0.01，其他處理濃度組中的畸形率沒有明顯差異(P>0.05)。在胚胎死亡率的統(tǒng)計上，與對照組比較，草甘膦處理組死亡率明顯上升(P<0.05)，尤其在10-3mol/L組中死亡率顯著增加(P<0.01)，神經(jīng)胚期觀察的10-3mol/L草甘膦藥物處理組死亡率呈顯著差異(P<0.05)，在所有組別中，畸形率都明顯大于死亡率，尤其在10-3mol/L的草甘膦處理組中畸形率明顯大于死亡率(P<0.01)。

注: WT.對照組， 無顯著性差異(P>0.05);*. P <0.05;**P<0.01Note:WT.Control,no significant difference (P>0.05);* P<0. 05;** P<0.01圖3 不同濃度草甘膦對熱帶爪蟾胚胎畸形率和死亡率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of glyphosate on embryonic malformation rate and mortality of Xenopus tropicalis

2.3草甘膦對不同時期熱帶爪蟾胚胎發(fā)育畸形率和死亡率的影響胚胎發(fā)育是一個個體不斷完善的動態(tài)過程，隨著發(fā)育的進(jìn)行，各部分組織和器官原基不斷形成。由圖4可知，不同時期胚胎的對照組與10-3mol/L草甘膦處理組比較畸形率明顯上升(P<0.05和P<0.01),同時在此處理組下，不同時期胚胎的畸形率隨著發(fā)育的進(jìn)行不斷減小。處理組中不同時期胚胎的死亡率也是早期比晚期高。因此，統(tǒng)計草甘膦處理胚胎后不同時期的胚胎對于體內(nèi)積累的毒素壓力承受能力，分析不同時期胚胎的畸形率和死亡率的變化情況，評定胚胎抵御外界壓力的能力。

注:WT.對照組， 無顯著性差異(P>0.05);* P<0.05;** P<0.01Note:WT.Control,no significant difference (P>0.05);* P<0.05;** P<0.01圖4 草甘膦對不同時期胚胎的畸形率和死亡率的影響Fig.4 Effect of glyphosate on malformation and mortality of embryos at different stages

3 討論

3.1草甘膦對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的影響爪蟾胚胎致畸YAA 試驗(FETAX)是檢測污染物發(fā)育毒性的常用檢測方法[11]，通過存活率、畸形率和抑制生長率等指標(biāo)來表征化合物的毒性強(qiáng)弱[12-13]，并在一定程度上反映受測污染物對機(jī)體的致畸機(jī)制[14，16]。試驗表明，當(dāng)草甘膦濃度達(dá)到10-3mol/L時，它對熱帶爪蟾胚胎有極顯著的毒性效應(yīng)影響(P<0.01)。伴隨著較高的死亡率，草甘膦對胚胎還有大量的致畸作用，有小眼、圍心腔水腫、尾部彎曲等畸形表型，其中表現(xiàn)出的腹方化是一種特異性的畸形表型。

這些結(jié)果可能是由于我們用草甘膦染毒對胚胎整個原腸期進(jìn)行處理，使得草甘膦的毒性聚集干擾了胚胎原腸運(yùn)動的進(jìn)行。而原腸運(yùn)動又是生命開始至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)[16]，在此期間伴隨著原腸細(xì)胞的時空定位指導(dǎo)組織和器官原基的形成，推動生命發(fā)生的有序進(jìn)程。如果此過程被阻斷，胚胎發(fā)育將產(chǎn)生缺陷如滯育、畸形甚至死亡。草甘膦處理熱帶爪蟾原腸期后，胚胎發(fā)育早期原腸末期導(dǎo)致胚孔不能閉合，神經(jīng)胚期部分神經(jīng)板不能正常形成，胚芽期后出現(xiàn)較為明顯的小眼、圍心腔水腫、尾部以及脊柱彎曲等畸形特征以及死亡現(xiàn)象。這些現(xiàn)象都可能是草甘膦積累毒性影響原腸運(yùn)動中一些細(xì)胞命運(yùn)決定基因的表達(dá)，從而影響胚胎發(fā)育。故而，接下來對于草甘膦致畸機(jī)制的研究，可從這一控制胚胎發(fā)育畸形表型基因著手。

除此之外，針對10-5mol/L草甘膦處理的胚胎的畸形率與死亡率小于對照組的胚胎這種現(xiàn)象，說明10-5mol/L和10-3mol/L 2種濃度的草甘膦的致畸機(jī)制不同，在10-5mol/L的濃度下，胚胎會受到某些因素的調(diào)控，使畸形率與死亡率比對照組低。可能的原因是胚胎抵御外界的能力在低濃度毒物暴露作用下升高的一種刺激反應(yīng)，稱此反應(yīng)為“毒物興奮效應(yīng)”[17-18]。

3.2草甘膦對于生態(tài)環(huán)境存在潛在危機(jī)除草劑是最有效和經(jīng)濟(jì)的雜草防治方法，中國作為一個農(nóng)業(yè)大國，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用除草劑，使主要農(nóng)藝作物田中的雜草防治問題基本解決[19-20]。隨著農(nóng)業(yè)科學(xué)不斷的發(fā)展，抗草甘膦作物研制成功，使草甘膦被廣泛迅速應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、園藝等作物雜草防治中。隨著大量的使用，生物富集不斷累加；通過食物鏈的各級消費(fèi)者途徑，無論是水生生物還是脊椎動物乃至人類體內(nèi)都會不斷殘留。大量研究結(jié)果證明，草甘膦對生物會產(chǎn)生明顯的毒性；草甘膦使用不當(dāng)，很可能造成潛在生態(tài)危機(jī)。熱帶爪蟾的基因組與人類基因組有很多的共性，草甘膦對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育產(chǎn)生明顯的毒性作用，這可能警示它可能影響人類的生存發(fā)育狀況。

4 結(jié)論

(1)草甘膦對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育有顯著的致毒作用；對胚胎死亡率、畸形率、體長造成影響，引起多種毒性效應(yīng)。

(2)草甘膦對熱帶爪蟾的發(fā)育毒性可能是其干擾胚胎原腸運(yùn)動過程中細(xì)胞命運(yùn)決定基因的表達(dá)，致使胚胎發(fā)育不能正常進(jìn)行。其次也可能是草甘膦影響胚胎內(nèi)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致胚胎抵御環(huán)境壓力能力減弱。

(3)熱帶爪蟾的基因組與人類基因組有相當(dāng)多的共性，更適合利用熱帶爪蟾做人類基因研究。因此，該試驗結(jié)果可以在一定條件下推廣至草甘膦對人類乃至其他脊椎動物的影響。