卷丹百合珠芽發(fā)育進程中矢車菊素的積累動態(tài)

張麗萍，張 恪，唐 楠，唐道城

(青海大學(xué)高原花卉研究中心，青海省園林植物重點實驗室， 青海西寧 810006)

卷丹百合(Liliumlancifolium)屬百合科百合屬卷瓣組，在我國廣泛分布。珠芽是卷丹百合特有器官，是由腋芽發(fā)育而成的小鱗莖，紫色，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)和花青素?；ㄇ嗨厥菑V泛存在于植物中的水溶性色素，種類多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，從而導(dǎo)致植物的花和果實等呈現(xiàn)多種色彩[1-2]?；ㄇ嗨夭⒉皇且恢贝嬖谟谥参锝M織中，而是在特定的發(fā)育時期才合成[3-4]。目前國內(nèi)關(guān)于卷丹百合的研究主要集中于鱗片繁殖、組織培養(yǎng)和脫毒快繁技術(shù)、高產(chǎn)栽培技術(shù)[5-7]等方面。Markakis[8]首次將HPLC法應(yīng)用于單個花色苷的分離；葉興乾等[9]采用紙層析、高效液相色譜(HPLC)、光譜分析等方法對荸薺種楊梅的花色苷進行研究，分離鑒定出其主要成分為矢車菊花色苷元-3-葡萄糖苷。由于花青素的結(jié)構(gòu)類型多，其成分復(fù)雜，易受提取分離的儀器、分離柱及溫度等的影響，因此在利用HPLC法測定花青素之前需要進行色譜條件的篩選與優(yōu)化。筆者利用HPLC法測定卷丹百合珠芽中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量，首先對HPLC的色譜條件進行優(yōu)化，然后對不同發(fā)育期珠芽提取物中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量進行測定，旨在了解珠芽發(fā)育進程中矢車菊素的動態(tài)變化，以期為卷丹百合珠芽中花青素開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑材料：珠芽采自互助縣威遠鎮(zhèn)青?；ヘS農(nóng)業(yè)科技集團公司實驗田，實驗田土壤為栗鈣土，年平均溫度4.5 ℃，平均降水量約400 mm。

標準品：矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品純度≥95%(SIGMA公司)。

1.2儀器與設(shè)備高效液相色譜儀(Agilent 1260)、C18固相色譜柱(5 μm，4.4 mm×150 nm Agilent ZORBAX SB-C18)、上海申順科技R-21旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3試驗方法

1.3.1采樣。從珠芽形成起始葉節(jié)，由下向上，對各株第3～5葉節(jié)的珠芽進行定位取樣。每14 d取珠芽樣1次，每次取3個重復(fù)，每重復(fù)至少30粒。

1.3.2標準液的制備。準確稱取1.00 mg標準品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷溶于1.00 mL 1%鹽酸甲醇溶液中配制成1 mg/mL的標準溶液，然后用1%鹽酸甲醇溶液稀釋成2、10、20、50、100 μg/mL標準品待測液，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.3樣品待測液的制備。參考文獻[10-16]的方法并加以改進，將珠芽冰上迅速切碎混合后液氮研磨成粉末，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。取1.0 g珠芽粉末，加入提取液(體積分數(shù)1%鹽酸甲醇)40 mL，4 ℃下靜置萃取48 h，取上清液用濾紙粗濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，0.45 μm微孔濾膜過濾，用體積分數(shù)1%鹽酸甲醇定容至25 mL，供上樣用。

1.4試驗設(shè)計篩選HPLC的測定條件時以標準品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷50 μg/mL進行檢測。

1.4.1流動相初選。Ⅰ.V(1%甲酸水溶液)∶V(1%甲酸乙腈溶液)=94∶6[10]；Ⅱ.V(0.04%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=95∶5[11]；Ⅲ.V(4%磷酸水溶液)∶V(乙腈)=88∶12(pH2.0)[12]；Ⅳ.V(10%醋酸水溶液)∶V(1%甲酸乙腈溶液)=90∶10[13]；Ⅴ.V(2%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=94∶6[14]；Ⅵ.V(0.5%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=88∶12[15]；Ⅶ.V(10%甲酸水溶液)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=94∶3∶3[16]。

1.4.2波長選擇。波長設(shè)定為510、515、520、525、530、535、540、545 nm。

1.4.3柱溫選擇。柱溫設(shè)定為20、25、30、35、40、45 ℃。

1.4.4流速選擇。流速設(shè)定為1.2、1.0、0.8、0.5、0.3 mL/min。

1.4.5矢車菊素定性分析。利用該試驗優(yōu)化確定的Agilent ZORBAX SB-C18柱；流動相A(0.04%甲酸水溶液)∶B(乙腈)=95∶5；流速0.5 mL/min；檢測波長520 nm；自動進樣10 μL；柱溫35 ℃，采用梯度洗脫，對標準品進行測定。

1.4.6矢車菊素定量分析。將5個不同濃度的標準品進行檢測。以峰面積為縱坐標(y)，矢車菊色素濃度為橫坐標(x)，得到花青素標準曲線的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.4.7回收率測定。分別精確吸取一定量的標準品溶液，加入到已知量的樣品中，按測定樣品含量的方法，測得3個濃度標準品的平均回收率。

1.4.8精密度測定。取同一批次的珠芽樣品溶液10 μL，連續(xù)進樣5次(n=5)，測定樣品花青素中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的峰面積，計算精密度RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1珠芽的發(fā)育進程由圖1可知，當植株葉節(jié)生長到12～14節(jié)時，珠芽開始形成，珠芽集中分布在12～60個葉節(jié)。 從珠芽形成到形態(tài)發(fā)育成熟約經(jīng)歷91 d。珠芽形成過程大致可以分成“魚雷期”“胎兒期”和“球形期”3個時期(圖1)，進入球形期后標志著形態(tài)發(fā)育基本“成熟”，并開始脫落。

注：a.魚雷期；b.胎兒期；c.球形期Note:a.Torpedo period;b.Fetal period;c.Spherical period.圖1 卷丹百合珠芽的形態(tài)變化Fig.1 The morphological changes of bulblet from Lilium lancifolium

2.2HPLC測定參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1流動相。通過對7個流動相的保留時間、峰寬、峰高、峰面積及對稱因子等(表1)各因素的綜合考慮，初步選擇流動相Ⅱ作為較優(yōu)流動相。由于流動相Ⅱ中的乙腈價格較高，后將乙腈換為甲醇，改后對出峰時間和峰面積均無不良影響。

表1 7個流動相色譜參數(shù)

2.2.2波長。由表2可知，波長520 nm處的峰高和峰面積最大，其余參數(shù)與各波長相近，故選擇520 nm作為優(yōu)選波長。

表2 HPLC法不同波長色譜參數(shù)

2.2.3柱溫。選擇峰面積率最高、對稱因子較高的35 ℃作為優(yōu)選柱溫(表3)。

表3 不同柱溫色譜參數(shù)

2.2.4流速。由表4可知，流速0.5 mL/min時出峰時間適中(9.655 min)，峰高適宜(72.470)，峰面積率較高(76.21%)，因此選用流速0.5 mL/min。

表4 不同流速色譜參數(shù)

2.2.5矢車菊素定性分析。利用該試驗優(yōu)化的色譜條件，對標準品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)進行測定，色譜圖見圖2。由圖2可知，矢車菊素的保留時間為(15.923 0±0.275 8)min。

圖2 標準品色譜圖Fig.2 Standard chromatogram

2.2.6矢車菊素定量分析。以峰面積為縱坐標(y)，矢車菊色素濃度為橫坐標(x)，得到花青素標準曲線(圖3)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù):y= 24.227x+5.390 3，R2=0.999 8。線性范圍為2～100 μg/mL，檢出限為0.34 μg/mL。

圖3 花青素標準曲線Fig.3 The standard curve of Anthocyanin

2.2.7回收率和精密度。矢車菊素的回收率為102.5%，峰面積的RSD=1.07%(n=5)。

2.3卷丹百合珠芽發(fā)育過程中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量分析由圖4可知，卷丹百合珠芽內(nèi)的矢車菊素含量隨著珠芽發(fā)育時間的延長，呈雙峰遞增趨勢。從肉眼可見(2 mm)起，生長7 d后其花青素含量達36.08 mg/kg，當珠芽生長到21 d時，含量達140.98 mg/kg，出現(xiàn)第一個“小高峰”；第21天后，珠芽的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量略有下降，第49～91天，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量急劇增加，至91 d時，珠芽內(nèi)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量達344.76 mg/kg，且不再增加。因此，珠芽發(fā)育至91 d是采集珠芽提取矢車菊素3-O-葡萄糖苷的最佳時間。此時珠芽形態(tài)發(fā)育基本成熟，每個珠芽平均重量0.048 08 g，每株平均生長29.27粒珠芽，平均每粒珠芽含矢車菊素-3-O-葡萄糖苷16.576 0 mg/kg，平均每株含矢車菊素-3-O-葡萄糖苷485.181 3 mg/kg。

圖4 卷丹百合珠芽發(fā)育進程中矢車菊素-3-O-菊萄糖苷積累量Fig.4 The accumulation of cyanin during bulbet development of Lilium lancifolium

3 結(jié)論與討論

在青海年平均氣溫5.5～8.0 ℃的地區(qū)，卷丹百合露地栽培地上部生長期180～190 d，且休眠鱗莖在-15.0 ℃下能安全越冬。出苗后45～60 d，葉腋珠芽開始形成，發(fā)育持續(xù)時間約91 d，形成過程大致可以分成“魚雷期”“胎兒期”和“球形期”3個時期，進入球形期后可作為“種子”或其他用途收獲。該試驗對Agilent 1260高效液相色譜儀測定卷丹百合珠芽矢車菊素-3-O-葡萄糖苷進行條件優(yōu)化，優(yōu)化后的條件與Markakis[8]、葉興乾等[9]對其他植物矢車菊花色苷元-3-葡萄糖苷的分離測定條件有較大差異。利用優(yōu)化條件對卷丹百合珠芽不同發(fā)育時間的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量進行測定，結(jié)果表明，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量隨著珠芽發(fā)育時間的延長，呈“雙峰”遞增趨勢，這主要與珠芽不同發(fā)育階段的發(fā)育中心有關(guān)，在第7～21天珠芽中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量隨珠芽體積增大而增加，到第21天，珠芽基本形態(tài)已經(jīng)建成，而珠芽中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量也出現(xiàn)第一個高峰，第21天后珠芽發(fā)育中心開始轉(zhuǎn)入中心芽即生長點的形成，部分已經(jīng)積累的養(yǎng)分向發(fā)育中心轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致此階段珠芽中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量略有下降，至第41天中心芽形態(tài)分化結(jié)束，并進入整個珠芽內(nèi)含物積累與充實階段，珠芽中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量又快速增加，但91 d達到第2個高峰，這與陳越等[17]對卷丹百合珠芽內(nèi)多糖、總皂苷、酚類和生物堿含量的變化規(guī)律研究結(jié)果一致。珠芽生長至91 d基本完成形態(tài)成熟，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量不再增加，達344.76 mg/kg，此時是采集珠芽提取花青素的最佳時間。矢車菊素是花青素的重要成分，具有重要的醫(yī)藥價值和保健價值， 同時還具有抗炎癥、抗腫瘤[18]等多種生物學(xué)活性的功效和具有改善缺鐵性貧血、降低血脂、預(yù)防動脈粥樣硬化、抗疲勞、抑制癌細胞的作

用[19-20]等。卷丹百合珠芽含有較豐富的花青素類各種成分，充分利用生長過程中的副產(chǎn)品，開發(fā)與花青素相關(guān)的醫(yī)藥和保健產(chǎn)品，對于增加卷丹百合的利用價值和收益具有十分重要的意義。