淋巴細胞主動免疫治療對反復胚胎種植失敗患者的臨床效果及T淋巴細胞因子水平變化的影響

陳 慧，劉仲偉，孟昱時△,李東婭，馬 蘭，楊曉玲

(1.昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，昆明 650101;2.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院生殖中心 423000)

20世紀80年代起，基于胚胎作為有異于母體組織抗原的同種免疫理論，學者提出了淋巴細胞主動免疫治療(lymphocyte immunotherapy，LIT)方法，并應用于復發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)患者[1]?；诜磸团咛シN植失敗(repeated implantation failure,RIF)與RSA患者可能存在類似的免疫失衡機制，學者推測不明原因的RIF可能是發(fā)生在種植10 d內的免疫排斥以致早期流產(chǎn)而著床失敗。嘗試性將LIT應用于RIF患者以調節(jié)免疫失衡，但其有效性及免疫調節(jié)機制在國內外仍存在爭議。本文探討LIT對RIF患者的臨床效果及T淋巴細胞因子水平變化的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014-2016年在昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科接受體外受精與胚胎移植(IVF-ET)助孕的不明原因RIF患者214例為研究對象，按是否接受LIT分為LIT組及對照組。入組標準[2]:胚胎移植大于或等于3次優(yōu)質胚胎，或累計移植優(yōu)質胚胎數(shù)大于或等于10枚仍未獲臨床妊娠；排除雙方染色體異常，輸卵管積水，內分泌紊亂，血栓前狀態(tài)，子宮內膜異常，多囊卵巢綜合征及子宮內膜異位癥等可能影響胚胎著床的不利因素[3]。本研究經(jīng)倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1LIT方案 按照李大金等[4]的操作方法，無菌抽取丈夫或健康第三者空腹靜脈血30 mL，適量肝素抗凝，在無菌條件下常規(guī)分離提取淋巴細胞，用生理鹽水洗滌3次，調節(jié)淋巴細胞濃度達到(20～30)×106/mL；對患者前臂外側行皮內注射，注射后30 min觀察是否出現(xiàn)紅腫、水泡等局部反應。每2～3周注射1次，4次為1個療程。

1.2.2胚胎移植及黃體支持 若有凍存胚胎，在行LIT 1個療程后行凍融胚胎移植。若無移植凍存胚胎，在LIT期間再次進入IVF-ET周期行超促排卵，在行LIT 1個療程后行新鮮胚胎移植。胚胎移植后采用黃體酮針劑/黃體酮陰道凝膠(雪諾酮每支90 mg，德國默克公司)、地屈孕酮片(每片10 mg，荷蘭蘇威公司)或人絨毛膜促性腺激素(HCG) 2 000 U進行黃體支持，持續(xù)用藥至妊娠8～10周。胚胎移植術后14 d檢測尿或者血HCG陽性確定為生化妊娠。胚胎移植術后28～35 d B超檢查見孕囊、胚芽及原始心管搏動為臨床妊娠。孕12周前發(fā)生的自然流產(chǎn)為早期流產(chǎn)。

1.2.3標本收集 2016年5-12月接受LIT患者21例，測定治療前后T淋巴細胞相關因子水平。患者在LIT治療前及治療1個療程后2周留取樣本，于8:00-10:00空腹抽取肘靜脈血5 mL，靜置15 min，4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min,取上層血清，置于-80 ℃冰箱，待測。采用ELISA檢測血清樣本中白細胞介素(IL)-10、IL-17、γ-干擾素(IFN-γ)、轉化生長因子β1(TGF-β1)細胞因子水平，并計算IFN-γ/IL-10和IL-17/TGF-β1比值。按照試劑盒說明書步驟操作。

2 結 果

2.1一般情況 接受LIT患者97例(LIT組)，未行LIT患者117例(對照組)，兩組患者一般情況比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。另21例檢測血清細胞因子水平的RIF患者平均年齡(33.00±4.01)歲，平均BMI(22.46±2.86)kg/m2，平均不孕時間(5.57±3.48)年，平均胚胎移植失敗(3.54±1.50)次。

表1 兩組患者一般情況比較

2.2臨床效果 LIT組患者胚胎種植率、臨床妊娠率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，流產(chǎn)率明顯低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組患者臨床效果比較[n/n(%)]

2.3治療前后血清細胞因子水平 21例RIF患者LIT治療后IFN-γ、IL-17水平、IL-17/TGF-β1比值較治療前下降(P<0.05)；IL-10及TGF-β1水平較治療前增高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 治療前后各細胞因子變化

續(xù)表3 治療前后各細胞因子變化

3 討 論

目前IVF-ET治療過程中，排除導致胚胎種植失敗的諸多可能因素外，如胚胎因素、宮腔因素、易栓癥等，仍有部分患者找不到原因，對于這部分患者治療手段有限，是當今研究的熱點和難點。

免疫因素是影響胚胎著床的主要因素之一，正常妊娠過程中只有母體的免疫耐受達到平衡狀態(tài)才能保護攜帶半異體抗原的胚胎免受母體的排斥，否則將導致胚胎著床失敗或流產(chǎn)。

免疫失衡具體的發(fā)病機制仍不明確，研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞免疫應答在胚胎反復種植失敗中發(fā)揮了重要的作用[5-8]。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ和腫瘤壞死因子β(TNF-β)，介導遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)和巨噬細胞活化等細胞免疫應答、炎性反應和急性排斥反應過程；Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，介導體液免疫應答，被認為是免疫調節(jié)性因子。有研究認為Th1細胞因子可干擾滋養(yǎng)細胞的侵蝕,并抑制子宮內膜蛻膜化，還可引起NK細胞的活化、浸潤,誘發(fā)妊娠早期滋養(yǎng)細胞凋亡,導致胚胎死亡[9]。Th2細胞因子作為免疫調節(jié)性因子,可以下調Th1的反應,從而誘導母體對胎兒產(chǎn)生免疫耐受。因此，Th1/Th2平衡在胚胎植入過程中起到了非常重要的作用。Th17細胞特征性分泌IL-17，而不產(chǎn)生IFN-γ和IL-4，參與移植排斥等的發(fā)生、發(fā)展。Treg細胞具有免疫無能和免疫抑制兩大功能特征，可分泌IL-9、IL-10及TGF-β等多種抑制性細胞因子。Treg細胞可抑制反應性CD4+T淋巴細胞和細胞毒性CD8+T淋巴細胞的活化、增殖與效應功能，能抑制半同種抗原引起的母體對胚胎的免疫排斥反應，在胚胎種植期及妊娠早期維持妊娠免疫耐受起重要作用[10]。

近幾年，少數(shù)學者將LIT應用于RIF患者的治療中。有研究[11-13]認為經(jīng)LIT治療RIF患者，可以從中獲得短期的明顯益處。有研究認為LIT能提高RIF患者的活產(chǎn)率，但僅僅針對有異常免疫風險的RIF患者[14]。另有研究認為LIT治療RIF的適應證有限[15]，并對臨床效果持反對態(tài)度，認為LIT可改善多次生化妊娠患者的再次生化妊娠現(xiàn)象，但不能改善RIF患者的妊娠結局。

本研究結果顯示，LIT組患者的胚胎種植率、臨床妊娠率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，流產(chǎn)率低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示LIT可改善RIF患者再次IVF-ET的胚胎種植率和臨床妊娠率；兩組流產(chǎn)率雖無明顯變化，但LIT組的流產(chǎn)率呈現(xiàn)下降趨勢。

LIT治療后IFN-γ、IL-17水平及IL-17/TGF-β1比值較治療前下降(P<0.05)；IL-10及TGF-β1水平較治療前增高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明Th17優(yōu)勢地位下降，Th17/Treg平衡向Treg轉化，這與文獻[16-17]對LIT的免疫調節(jié)機制的研究結論相一致，進一步說明LIT通過下調Th1因子和上調Treg因子的表達,調節(jié)母胎免疫耐受從而利于胚胎植入。

綜上所述，LIT可以改善RIF患者再次IVF-ET的結局；LIT對Th1細胞因子下調作用更加明顯，而對于Th2細胞因子的調節(jié)作用不明顯。本研究樣本量有限，還有待于擴大樣本量做進一步研究。