MUC6基因多態(tài)性與幽門螺旋桿菌感染的關(guān)聯(lián)性研究

高 芳，秦金東，馬立聰，2，劉得利，李晶晶，賈彥彬,2△

(1.包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)蒙古消化病研究所，內(nèi)蒙古包頭 014030;3.包鋼第三職工醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古包頭 014010)

幽門螺旋桿菌(H.pylori)是一革蘭陰性菌，選擇性地寄居在胃黏膜層，引起淺表性胃炎，增加人體發(fā)生萎縮性胃炎、腸上皮化生及胃癌的風(fēng)險(xiǎn)[1]。1994年，世界衛(wèi)生組織把H.pylori定為胃的Ⅰ類致癌原。大量的研究表明:H.pylori感染引發(fā)的慢性炎癥與胃癌的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切[2-3]。

黏蛋白是一種在黏膜黏液層分布的高度糖基化的蛋白，覆蓋于上皮組織表面[4]，對(duì)正常的胃黏膜起潤(rùn)滑和保護(hù)作用。研究表明，正常胃黏膜的胃體頸黏液細(xì)胞和腺體主要表達(dá)黏蛋白MUC6[5]。同時(shí)研究顯示：H.pylori感染還能夠改變MUC6基因表達(dá)[6]。而且，在胃癌的發(fā)生過(guò)程中MUC6基因異常表達(dá)[7]。然而，這一相關(guān)性是否是MUC6基因多態(tài)性通過(guò)影響H.pylori感染引起的未見報(bào)道。本研究主要采用標(biāo)記單核苷酸多態(tài)性(tag-single nucleotide polymorphism,Tag-SNP)途徑，研究在內(nèi)蒙古包頭地區(qū)漢族人群中，MUC6基因多態(tài)性與H.pylori感染的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2008年9月至2010年6月包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢者281例，其中女61例，男220例，年齡26～85歲，平均(59.10±11.57)歲。所有研究樣本情況：在包頭生活5年以上，漢族，互無(wú)血緣關(guān)系。排除高血壓、糖尿病、萎縮性胃炎、不完全腸轉(zhuǎn)化、胃及十二指腸潰瘍等疾病，均無(wú)癌癥病史。未做過(guò)H.pylori清除治療及胃部手術(shù)。所有樣本均提供2 mL血和知情同意書，經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1H.pylori感染檢測(cè) 采用ELISA檢測(cè)血清抗HP-CSAs IgG抗體(H.pyloriIgG試劑盒購(gòu)自芬蘭BIOHIT公司)。H.pylori感染陽(yáng)性：血清H.pyloriIgG抗體滴度大于或等于30 EIU。

1.2.2SNP的選擇 根據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov)中中國(guó)人的數(shù)據(jù)，使用Agorithm-Tagger-pairwise Tagging軟件篩選Tag-SNP，其中參數(shù)MAF>5%、r2>0.8用于選擇。

1.2.3基因分型 基因組DNA從外周血白細(xì)胞中提取：蛋白酶K起消化作用，酚/氯仿提取，最后用乙醇沉淀。采用TaqMan法對(duì)篩選到的6個(gè)SNP進(jìn)行基因分型，基因分型在北京諾賽基因組有限公司完成，操作按照生產(chǎn)廠商的說(shuō)明進(jìn)行(美國(guó)Applied Biosystems公司)。6個(gè)SNP的基因分型的成功率達(dá)到90%以上，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，并隨機(jī)抽取5%DNA結(jié)果好的樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)基因型，結(jié)果100%一致。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。對(duì)同一染色體上的不同位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析時(shí)，使用Haploview軟件；單體型塊的劃分采用D′置信區(qū)間法。用非條件性Logistic回歸計(jì)算比值比(odds ratio,OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)，評(píng)價(jià)各等位基因、基因型及單體型與H.pylori感染的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié) 果

2.1MUC6各SNP位點(diǎn)等位基因與H.pylori感染的關(guān)系 在281例樣本中，SNP rs10794282、rs10794279、rs11246386、rs10751638、rs11826309、rs10794359的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。研究結(jié)果顯示，所有檢測(cè)SNP位點(diǎn)的等位基因在H.pylori感染陽(yáng)性和陰性人群中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。由于有缺失的數(shù)據(jù)，因此列之和不及樣本的等位基因總數(shù)。

2.2MUC6各SNP位點(diǎn)基因型與H.pylori感染的關(guān)系 SNP rs10794282、rs10794279、rs11246386、rs10751638、rs11826309、rs10794359位點(diǎn)的基因型與H.pylori感染無(wú)關(guān)聯(lián)，見表2。

表1 各SNP位點(diǎn)等位基因與H.pylori感染的關(guān)聯(lián)分析

#：平衡性別和年齡因素

表2 各SNP位點(diǎn)基因型與H.pylori感染的關(guān)聯(lián)分析

續(xù)表2 各SNP位點(diǎn)基因型與H.pylori感染的關(guān)聯(lián)分析

#:平衡了性別和年齡因素

2.3MUC6單體型與H.pylori感染的關(guān)系 對(duì)MUC6基因不同位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)rs10794359-rs11826309(Block 1)之間存在強(qiáng)連鎖不平衡，構(gòu)成單體型區(qū)域。分析結(jié)果顯示各單體型在H.pylori感染陽(yáng)性和陰性人群中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 MUC6基因單體型與H.pylori感染的關(guān)系

3 討 論

目前，H.pylori感染是全球范圍內(nèi)一個(gè)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題[8]。孫文峰等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，丹東地區(qū)H.pylori感染率為68.61%，建立良好的飲食習(xí)慣可有效地預(yù)防。值得關(guān)注的是，絕大多數(shù)人感染了H.pylori，都不會(huì)出現(xiàn)惡心、胃脹、胃疼等不適癥狀，也不會(huì)發(fā)展成胃潰瘍和胃癌。歸其原因，主要從不同菌株的特異性、環(huán)境因素和宿主易感性三方面來(lái)解釋[10]。BLASER[11]的研究表明：在胃癌的發(fā)生過(guò)程中，宿主遺傳因素發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。但個(gè)體從感染H.pylori到胃癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟的過(guò)程：經(jīng)過(guò)了萎縮性胃炎，腸化生，胃十二指腸潰瘍等階段；人一旦發(fā)生了萎縮性胃炎，H.pylori就失去了定植的土壤，其感染率反而降低，腸化生、胃十二指腸潰瘍亦之。除此之外，人們一旦有萎縮性胃炎等胃部炎癥時(shí)，就濫用抗生素，間接使H.pylori感染率下降。為了避免結(jié)果的偏移，因此把萎縮性胃炎、腸化生和胃十二指腸潰瘍患者排除在研究外。

黏蛋白是一組高分子量的糖蛋白，形成天然的保護(hù)屏障：“黏液-碳酸氫鹽屏障”，可有效地保護(hù)胃黏膜。在生理?xiàng)l件下，黏蛋白存在組織特異性表達(dá)，其中MUC2、MUC3和MUC4主要在腸道中占優(yōu)勢(shì)，而MUC1、MUC5AC和MUC6主要在胃中表達(dá)。MUC6是正常胃黏液中的一種分泌性黏蛋白，H.pylori感染可改變胃黏膜上皮黏液的分泌，直接決定胃黏液屏障的保護(hù)效果。H.pylori定植宿主后，可產(chǎn)生許多有害物質(zhì)如細(xì)胞毒素、黏附素、尿素酶等損害正常胃黏膜細(xì)胞，同時(shí)MUC6表達(dá)增加并伴隨MUC5AC的水平下調(diào)，減弱了胃黏液蛋白的保護(hù)作用，加重了胃部炎性反應(yīng)[12]。

H.pylori感染與基因單核苷酸多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性增加，值得關(guān)注[13-14]。大量的研究表明，在胃癌變的過(guò)程中，H.pylori感染后可導(dǎo)致MUC1、MUC5AC和MUC6等基因發(fā)生變異[15-17]。

MUC6基因位于11號(hào)染色體，短臂15區(qū)5帶[18]，共33個(gè)外顯子，是胃癌分子遺傳學(xué)研究的重要候選基因之一。REIS等[19]研究顯示在胃癌發(fā)生過(guò)程中MUC6基因表達(dá)異常，可能與胃癌有關(guān)。此外，汪榮泉等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者H.pylori感染可導(dǎo)致胃黏膜組織中MUC6 黏蛋白表達(dá)下調(diào)，提示破壞胃黏膜的保護(hù)屏障。因此，在本研究中采用TaqMan法探討了MUC6基因多態(tài)性與H.pylori感染的關(guān)系。結(jié)果顯示：包頭地區(qū)漢族人群中MUC6 SNP rs10794282、rs10794279、rs11246386、rs10751638、rs11826309、rs10794359與H.pylori感染無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。同時(shí)，各單體型在H.pylori感染陽(yáng)性和陰性人群中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在JIA等[21]的研究中，沒(méi)有數(shù)據(jù)表明MUC6常見SNP與H.pylori感染相關(guān)，這與本研究是一致的。當(dāng)然，還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)本研究。