拉西地平對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠模型血管內(nèi)皮的保護(hù)作用及機(jī)制分析

卞龍艷,武 玲,朱 慧

(1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院,江蘇鹽城 224005;2.江蘇省鹽城市婦幼保健醫(yī)院護(hù)理部 224002)

高血壓作為一種常見(jiàn)的慢性病，是引發(fā)心腦血管疾病的主要因素，高血壓的發(fā)病原因較復(fù)雜，是由多因素、多基因共同作用的結(jié)果[1-3]。目前，關(guān)于高血壓的發(fā)病機(jī)制尚未明確，其相關(guān)研究仍是熱點(diǎn)，為了更好地探究其病理機(jī)制，動(dòng)物模型成為一種必要的手段。SHR是一種自發(fā)性高血壓大鼠模型，其血管出現(xiàn)舒張功能減退和重塑，與人類接近[4]。血管內(nèi)皮功能障礙是高血壓發(fā)病的重要因素，高血壓患者的血管內(nèi)皮功能異常，進(jìn)而引發(fā)其他臟器病變[5]。腸系膜動(dòng)脈舒張度能夠反映血管的內(nèi)皮功能狀態(tài)[6]。內(nèi)皮素(endothelin，ET)作為一種強(qiáng)血管收縮劑，參與高血壓的發(fā)生、發(fā)展[7]。一氧化氮(nitric oxide，NO) 作為一種血管內(nèi)皮舒張因子，能夠調(diào)節(jié)血管張力，維持血壓穩(wěn)定[8]。間隙連接蛋白(connexin，Cx)是連接兩個(gè)相鄰細(xì)胞的主要組分，其能夠維持血管壁細(xì)胞之間的正常信息交流，保障血管的同步舒縮，從而發(fā)揮其正常功能[9]。血管炎癥反應(yīng)參與高血壓的病理機(jī)制，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為一種炎癥因子，能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，造成血管收縮，血壓升高[10]。研究發(fā)現(xiàn)，拉西地平能夠選擇性的阻滯血管平滑肌的鈣通道，擴(kuò)張血管，降低血壓[11]。此外，拉西地平還具有抗氧化性，能夠保護(hù)血管[12]。本研究采用自發(fā)性高血壓大鼠模型，探討拉西地平對(duì)其血管內(nèi)皮的保護(hù)作用，并分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取20周齡的SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠50只為WKY組，20周齡的雄性自發(fā)性高血壓大鼠50只為SHR組，體質(zhì)量(250±10)g，購(gòu)自北京維通利華有限責(zé)任公司。 將50只WKY組大鼠分為兩組，分別為WKY對(duì)照組和WKY研究組，每組25只。將50只SHR組大鼠分為兩組，分別為SHR對(duì)照組和SHR研究組，每組25只。各組大鼠在種類、鼠齡和體質(zhì)量方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1造模 所有大鼠均在清潔級(jí)環(huán)境中標(biāo)準(zhǔn)飼料，恒溫(21±2)℃，恒濕(55±5)%，人工光照每晝夜12 h，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。WKY研究組和SHR研究組大鼠給予拉西地平(西班牙葛蘭素威康集團(tuán)，批準(zhǔn)文號(hào)：注冊(cè)證號(hào)H20140294)0.72 mg/kg灌胃處理，WKY對(duì)照組和SHR對(duì)照組大鼠給予等體積的生理鹽水(氯化鈉注射液，杭州民生藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H33021575)，每天1次，持續(xù)8周。

1.2.2平均動(dòng)脈壓 干預(yù)前、干預(yù)后采用無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)BP-98A/B型在大鼠清醒狀態(tài)下檢測(cè)尾動(dòng)脈收縮壓，測(cè)量3次，取平均值。

1.2.3腸系膜動(dòng)脈舒張度 采用脫頸椎法將大鼠處死后，取其腸系膜動(dòng)脈，置于Krebs Hensenleit(K-H)溶液中，并將其剪成3 mm左右的血管環(huán)。血管功能測(cè)定系統(tǒng)的37 ℃恒溫槽內(nèi)持續(xù)充入5% CO2和95%O2的混合氣體，將血管環(huán)一端固定在槽底，另一端連接張力換能器。在K-H溶液中加入60 mmol/L KCl進(jìn)行預(yù)收縮，待血管拉力達(dá)到峰值后，加入 0.1 mmol/L乙酰膽堿，比較各組大鼠腸系膜上動(dòng)脈的舒張性，判斷血管內(nèi)皮功能。

1.2.4主動(dòng)脈Cx37蛋白表達(dá)水平 各組大鼠分別于干預(yù)后，采用脫頸椎法將大鼠處死取其主動(dòng)脈，采用Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈Cx37蛋白表達(dá)水平。將動(dòng)脈置于RIPA緩沖液中，在冰上充分研磨，離心取上清液，進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉1 h，一抗4 ℃過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液清洗3次，ECL反應(yīng)1 min，曝光，顯影，采用BCA法測(cè)定蛋白水平。

1.2.5血漿ET、血清NO及TNF-α水平 各組大鼠分別于干預(yù)后處死前采用腹主動(dòng)脈取血法，每只大鼠分別采集3支試管的血液標(biāo)本5 mL，1支試管加入抗凝劑混勻，4 ℃，3 500 r/min離心10 min，取上清；另2支試管，常溫靜置20 min后，以3 000 r/min離心5 min，取上清，均轉(zhuǎn)移至新試管待測(cè)，采用ELISA檢測(cè)ET、TNF-α水平，硝酸還原法檢測(cè)NO水平，試劑盒均購(gòu)于美國(guó)IBL公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠平均動(dòng)脈壓比較 干預(yù)前后，WKY研究組和WKY對(duì)照組大鼠平均動(dòng)脈壓比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SHR研究組和SHR對(duì)照組大鼠平均動(dòng)脈壓明顯高于WKY研究組和WKY對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與干預(yù)前比較，干預(yù)后的SHR研究組大鼠平均動(dòng)脈壓明顯降低，且明顯低于SHR對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠平均動(dòng)脈壓比較

2.2各組大鼠腸系膜上動(dòng)脈舒張度比較 WKY研究組和WKY對(duì)照組大鼠腸系膜上動(dòng)脈舒張度分別為(92.14±5.71)%、(91.34±5.67)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與WKY研究組和WKY對(duì)照組相比較，SHR研究組和SHR對(duì)照組大鼠腸系膜上動(dòng)脈舒張度(63.72±4.31)%、(36.48±6.53)%明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對(duì)照組(P<0.05)。

2.3各組大鼠主動(dòng)脈Cx37蛋白表達(dá)水平比較 WKY研究組和WKY對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈Cx37蛋白表達(dá)水平0.98±0.09、1.02±0.08，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與WKY研究組和WKY對(duì)照組相比較，SHR研究組和SHR對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈Cx37蛋白表達(dá)水平0.74±0.07、0.58±0.06明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈Cx37蛋白表達(dá)水平

組別nET(pg/mL)NO(μmol/g)TNF-α(μmol/g)SHR研究組252.16±0.820.62±0.0592.05±18.24SHR對(duì)照組253.85±1.040.41±0.07152.42±34.87WKY研究組251.67±0.490.75±0.0643.42±19.73WKY對(duì)照組251.64±0.530.77±0.0445.32±21.06

2.4各組大鼠血漿ET、血清 NO及TNF-α水平比較 WKY研究組和WKY對(duì)照組大鼠血漿ET、血清 NO及TNF-α水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與WKY研究組和WKY對(duì)照組比較，SHR研究組和SHR對(duì)照組大鼠血漿ET水平、血清 TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，而SHR研究組明顯低于SHR對(duì)照組(P<0.05)；SHR研究組和SHR對(duì)照組大鼠血清 NO水平明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

3 討 論

高血壓是常見(jiàn)的慢性病，也是心腦血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。高血壓的發(fā)病機(jī)制和發(fā)病因素較復(fù)雜，血管內(nèi)皮功能障礙是引發(fā)高血壓的主要因素。血管內(nèi)皮是介于血液和血管壁之間的一道屏障，其能夠維持血管壁結(jié)構(gòu)，參與免疫反應(yīng)，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)[13]。研究報(bào)道SHR機(jī)體內(nèi)普遍存在內(nèi)皮功能障礙，血管舒張功能失衡引發(fā)血壓升高，而持續(xù)的血壓升高又導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，二者是相互促進(jìn)的惡性循環(huán)[14]。由于高血壓患者均存在血管內(nèi)皮功能損傷，改善患者的血管內(nèi)皮功能是防治高血壓病情發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。拉西地平一方面作為一種二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，能夠選擇性阻滯血管平滑肌的鈣通道，擴(kuò)張血管，降低血壓；另一方面具有抗氧化性，能夠降低氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)血管內(nèi)皮的損傷作用，二者共同發(fā)揮保護(hù)血管的作用。

本研究結(jié)果顯示，與干預(yù)前相比較，干預(yù)后的SHR研究組大鼠平均動(dòng)脈壓明顯降低，且低于SHR對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明拉西地平能夠有效降低自發(fā)性高血壓大鼠的平均動(dòng)脈壓。由于拉西地平具有高度的血管選擇性，從而發(fā)揮強(qiáng)力降壓作用。

動(dòng)脈舒張度反映血管的彈性功能，高血壓患者的動(dòng)脈彈性隨著血壓的升高而減退[15]。造成這一現(xiàn)象的原因可能是高血壓引起脈壓增加，進(jìn)而造成大動(dòng)脈僵硬度增加，導(dǎo)致血管壁所受壓力增大，血管內(nèi)皮受損，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成。本研究結(jié)果顯示，與WKY研究組和WKY對(duì)照組比較，SHR研究組和SHR對(duì)照組大鼠腸系膜上動(dòng)脈舒張度明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明自發(fā)性高血壓大鼠的血管內(nèi)皮功能受損，而采用拉西地平干預(yù)后，這種受損狀態(tài)得到改善。拉西地平的作用機(jī)制可能為通過(guò)調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)，作用于鈣通道，擴(kuò)張動(dòng)脈，減低血管阻力，降低血壓，另外，其具有抗氧化性，能夠降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少血管內(nèi)皮的過(guò)氧化損傷，避免血壓升高和血管內(nèi)皮功能障礙的惡性循環(huán)。

血管發(fā)揮正常的功能需要血管同步舒縮，而這依賴于血管壁細(xì)胞之間通訊系統(tǒng)的完整性。血管緊張度升高是引發(fā)心腦血管疾病的關(guān)鍵，表現(xiàn)為細(xì)胞間的電化學(xué)信息交流異常。文獻(xiàn)報(bào)道高血壓的發(fā)生、發(fā)展與間隙連接蛋白的異常有關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，與WKY研究組和WKY對(duì)照組比較，SHR研究組和SHR對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈Cx37蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明自發(fā)性高血壓大鼠的血管壁細(xì)胞間縫隙連接的通訊異常，而采用拉西地平干預(yù)后，這種通訊狀態(tài)得到改善。推測(cè)高血壓可能降低Cx37蛋白表達(dá)水平，從而使細(xì)胞間縫隙連接的通訊異常，造成血管內(nèi)皮功能紊亂，加重高血壓，而采用拉西地平干預(yù)后，由于其能夠降低血壓，改善血管內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)細(xì)胞間縫隙連接的正常通訊。

血管內(nèi)皮通過(guò)分泌多種血管活性物質(zhì)，例如血管舒張和收縮、氧化和抗氧化、炎癥和抗炎等因子，維持血管內(nèi)環(huán)境和血管內(nèi)皮功能的穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)在高血壓病理狀態(tài)下，血壓持續(xù)升高會(huì)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而造成血管內(nèi)皮功能障礙，引起ET水平升高，NO水平降低，導(dǎo)致血管收縮作用增強(qiáng)，舒張作用減弱，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，血管平滑肌細(xì)胞增殖，血壓進(jìn)一步升高[17]。研究報(bào)道，在高血壓的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，炎性反應(yīng)起著重要作用，TNF-α、IL-6等因子的持續(xù)高水平表達(dá)可進(jìn)一步加重血管內(nèi)皮損傷。本研究結(jié)果顯示，與WKY研究組和WKY對(duì)照組比較，SHR研究組和SHR對(duì)照組大鼠血漿ET、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，而SHR研究組明顯低于SHR對(duì)照組(P<0.05)；SHR研究組和SHR對(duì)照組大鼠血清 NO水平明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明自發(fā)性高血壓大鼠的血管內(nèi)皮損傷，而采用拉西地平干預(yù)后，血管內(nèi)皮功能得到改善。推測(cè)高血壓可能造成內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而引起ET水平升高，NO水平降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，導(dǎo)致血管舒縮功能失衡，血管內(nèi)皮功能障礙，血壓升高。采用拉西地平干預(yù)后，由于其能夠降低血壓，避免血管內(nèi)皮功能損傷加重，此外還能夠促進(jìn)細(xì)胞間縫隙連接的正常通訊，進(jìn)而調(diào)節(jié)ET、NO等因子的表達(dá)水平，促進(jìn)血管內(nèi)皮功能恢復(fù)，同時(shí)其具有抗氧化性，能夠抑制炎性反應(yīng)，減少生成氧化產(chǎn)物，改善血管內(nèi)皮功能損傷。

綜上所述，拉西地平能夠有效降低自發(fā)性高血壓大鼠的平均動(dòng)脈壓，保護(hù)血管內(nèi)皮，其可能通過(guò)以下幾個(gè)方面：能夠選擇性阻滯血管平滑肌的鈣通道，擴(kuò)張血管，降低血壓；能夠調(diào)節(jié)Cx37蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞間縫隙連接通訊正常，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管舒張、收縮因子(NO、ET)的表達(dá)，維持正常血壓，避免內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷加重；具有抗氧化性，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥反應(yīng)，減輕血管內(nèi)皮的損傷。