DAPK在人食管鱗癌組織及食管癌EC9706細(xì)胞中的表達(dá)及其對食管鱗癌轉(zhuǎn)移侵襲的影響

賈敬周,孫繼偉,袁五營,侯智亮,王文波,趙正國

(1.河南省胸科醫(yī)院微創(chuàng)外科,鄭州 450000；2.河南省鄭州市第七人民醫(yī)院普外科 450002)

食管鱗癌是我國居民消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率僅次于肝癌、胃癌、肺癌，以侵襲性強(qiáng)、致死性高為臨床特點(diǎn)，對居民健康造成嚴(yán)重危害[1]。雖然近年來食管癌的診治技術(shù)有了明顯提高，但依然存在生存率低、預(yù)后差等特點(diǎn)，因此深入研究食管鱗癌的具體轉(zhuǎn)移、遷移機(jī)制尤為重要[2]。

死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛參與機(jī)體多種病理生理過程，并在多種癌組織中異常表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)DAPK在非小細(xì)胞肺癌肺組織中的陽性表達(dá)率為34.7%，明顯低于癌旁正常肺組織的82.6%[3]。近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)DAPK在一系列癌細(xì)胞遷移中具有重要調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并已被證實(shí)在多種實(shí)體瘤及其細(xì)胞系中DAPK的表達(dá)缺失與腫瘤侵襲有關(guān)[4]，但未見DAPK在人食管鱗癌組織及食管癌EC9706細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過人食管鱗癌組織樣本及人食管癌EC9706細(xì)胞檢測DAPK的表達(dá)，探討其與食管癌的關(guān)系，進(jìn)一步研究DAPK過表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的作用，旨在為食管癌的臨床治療及預(yù)后提供新的思路和尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標(biāo)本與細(xì)胞 人食管鱗癌組織及癌旁正常組織(距癌變組織3 cm以上并經(jīng)組織病理學(xué)診斷無癌變)標(biāo)本各20例，均為河南省胸科醫(yī)院微創(chuàng)外科及胸外科2016年5月至2017年6月的手術(shù)病理切除凍存標(biāo)本，其組織學(xué)類型均為食管鱗癌。其中男12例，女8例，年齡45～72歲，平均(55.26±10.28)歲，患者術(shù)前均未行放療及化療。人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞由中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物研究中心提供。

1.1.2儀器與試劑 10%胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素、IMDM培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司；Transwell小室購自美國Corning公司；鼠抗人DAPK單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體及兔抗小鼠二抗購自美國Sigma Aldrich公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，pReceiver-M29-DAPK質(zhì)粒和pReceiver-M29質(zhì)粒購自廣州復(fù)能生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白分析試劑盒購自美國Pierce公司；RT-PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本Takara公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；MK3型酶標(biāo)儀和PCR儀購自美國Bio-Rad公司；HER Acell型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Sim公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法檢測人食管鱗癌組織及癌旁正常組織中DAPK的表達(dá) 所有組織標(biāo)本均由病理科經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋后保存。每組隨機(jī)選取10個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本取3張切片，按照免疫組織化學(xué)S-P法染色[5]，采用檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)高溫高壓抗原修復(fù)，常規(guī)透膜，5% BSA室溫封閉1 h，滴加DAPK鼠抗人多克隆抗體(1∶250)4 ℃過夜，生物素標(biāo)記的二抗(1∶1 000) 37 ℃孵育1 h，DAB顯色，自來水沖洗終止，蘇木精復(fù)染后脫水、封片。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，用光學(xué)顯微鏡測定觀察區(qū)域陽性細(xì)胞數(shù)，并分級(jí)計(jì)算陽性率。陽性標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕褐色顆粒。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：陰性(-)，陽性細(xì)胞少于10%；弱陽性(+)，陽性細(xì)胞11%～50%；強(qiáng)陽性(++)，陽性細(xì)胞超過50%。陽性率=(弱陽性數(shù)+強(qiáng)陽性數(shù))/總數(shù)×100%。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將EC9706細(xì)胞復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至IMDM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)并進(jìn)行傳代，取2～3次傳代后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板中，密度為8×105個(gè)/孔，保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為80%～90%。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備 將培養(yǎng)好的EC9706細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每孔1 500 μL細(xì)胞懸液；取250 μL Opti-MEMI無血清培養(yǎng)基用于稀釋4.0 μg pReceiver-M29-DAPK質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染組)；另取250 μL Opti-MEMI無血清培養(yǎng)基用于稀釋10 μL的LipofectamineTM2000；將以上兩種稀釋的液體混勻并于室溫放置20 min，取500 μL依次加入培養(yǎng)好的EC9706細(xì)胞內(nèi)。置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)?？蛰d脂質(zhì)體pReceiver-M29(空白轉(zhuǎn)染組)轉(zhuǎn)染條件同轉(zhuǎn)染組，并以未轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞為對照組。

1.2.4Western blot檢測DAPK蛋白的表達(dá) 提取上述各組轉(zhuǎn)染前后的EC9706細(xì)胞總蛋白，變性后每孔50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含有5%脫脂牛奶的0.1%TBS-T室溫封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜，TBS-T洗膜10 min×5次，加HRP連接的兔抗鼠IgG 4 ℃振搖孵育1 h，TBS-T洗膜10 min×5次，用新鮮配制的DAB顯色液顯色，成像[6]。

1.2.5劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測EC9706細(xì)胞遷移能力 取100 μL上述培養(yǎng)好的EC9706細(xì)胞接種于6孔板中，待各組細(xì)胞單層生長鋪滿板底時(shí)，用移液槍頭沿培養(yǎng)板底部劃“一”字型劃痕。各組EC9706細(xì)胞于37 ℃、飽和濕度及5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h。光學(xué)顯微鏡下觀察各組EC9706細(xì)胞向致傷區(qū)遷移的相對距離并拍照，隨后計(jì)算EC9706細(xì)胞遷移率[7]，細(xì)胞遷移率=轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移面積/空白組細(xì)胞遷移面積×100%。

1.2.6Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測EC9706細(xì)胞侵襲能力 Transwell 小室使用前鋪上10 μL的0.5% Matrigel 膜基質(zhì)并于37 ℃孵育過夜。分別取200 μL上述培養(yǎng)好的EC9706細(xì)胞懸液接種于Transwell 小室上室，并在Transwell小室下室加入600 μL含有20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。隨后各組EC9706細(xì)胞于37 ℃、飽和濕度及5% CO2環(huán)境下孵育培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，擦去上室內(nèi)細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色，轉(zhuǎn)用33%醋酸溶液洗脫，在Leica DC300F顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察并拍照，計(jì)算細(xì)胞計(jì)數(shù)[8]。同樣的步驟重復(fù)3次并取其均值。

2 結(jié) 果

2.1人食管鱗癌組織及癌旁組織中DAPK的表達(dá) 人食管鱗癌組織DAPK的陽性率為90.0%，明顯高于癌旁正常組織的13.3%(P<0.05)，見表1；在人食管鱗癌組織中DAPK的陽性區(qū)域面積明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，見圖1。

表1 DAPK在人食管鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2DAPK在EC9706細(xì)胞中的表達(dá) 蛋白印跡法(Western blot)顯示，在對照組和空白轉(zhuǎn)染組中未見明顯DAPK蛋白表達(dá)，DAPK蛋白在轉(zhuǎn)染pReceiver-M29-DAPK的EC9706細(xì)胞中高表達(dá)，見圖2。

2.3DAPK對EC9706細(xì)胞遷移能力的影響 與對照組細(xì)胞遷移率(36.42±8.52)%比較，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移率(83.26±8.42)%明顯升高(P<0.01)，空白轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移率(43.45±11.56)%無明顯變化(P>0.05)，見圖3。

A:癌旁正常組織；B：食管鱗癌組織

圖1 DAPK在人食管鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)(×400)

1:對照組；2：空白轉(zhuǎn)染組；3：轉(zhuǎn)染組

圖2轉(zhuǎn)染前后EC9706細(xì)胞DAPK蛋白的表達(dá)

A:對照組；B：空白轉(zhuǎn)染組；C：轉(zhuǎn)染組

圖3 DAPK對EC9706細(xì)胞劃痕修復(fù)的影響(×100)

2.4DAPK對EC9706細(xì)胞侵襲能力的影響 與對照組侵襲細(xì)胞數(shù)(50.2±4.3)個(gè)比較，轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)(162.6±4.8)個(gè)明顯升高(P<0.01)，空白轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)(46.45±7.5)個(gè)無明顯變化(P>0.05)，見圖4。

A:對照組；B：空白轉(zhuǎn)染組；C：轉(zhuǎn)染組

圖4 DAPK對EC9706細(xì)胞體外侵襲的影響(×100)

3 討 論

食管癌是世界上第八大常見癌癥，也是導(dǎo)致因癌癥死亡的第六大誘因，近年來估計(jì)每年有456 000例新發(fā)病例和400 000例死亡病例[9]。根據(jù)中國最新的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，食管癌的病死率在男性中位居第三，女性中位居第五，呈逐年升高趨勢。食管癌可分為食管鱗癌和食管腺癌，它們是組織病理學(xué)、流行病學(xué)和分子學(xué)完全不同的兩種亞型[10]。食管鱗癌占全球食管癌病例的90%左右，而食管鱗癌患者的5年生存率盡管在過去10年有所改善，但仍然普遍較差。許多患者在診斷時(shí)表現(xiàn)出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤侵襲鄰近器官，缺乏有效的化療方法用于治療食管鱗癌患者[11]。因此，對食管癌致病機(jī)制需要進(jìn)一步研究探討，以便為患者尋求更佳的治療手段。

DAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，廣泛參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生命過程，如凋亡、自噬、細(xì)胞遷移等。DAPK在Ser308上磷酸化從而抑制了其在該位點(diǎn)的催化活性和去磷酸化，這也是DAPK被活化的重要標(biāo)志。DAPK及其相關(guān)信號(hào)通路廣泛參與多種疾病，如癌癥、中風(fēng)、炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化等[12]。

DAPK的功能在多種疾病中均受不同程度的影響。與p53等基因不同，DAPK在癌癥中的功能障礙通常是由于表達(dá)喪失而不是突變。DAPK表達(dá)缺失主要是由DAPK基因50UTR處的高甲基化引起的，盡管頻率不高也可能是純合缺失的結(jié)果[13]。在30多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了DAPK基因甲基化，非小細(xì)胞肺癌的原發(fā)性組織和細(xì)胞系中DAPK蛋白仍然可以在高甲基化存在下表達(dá)。在其他如腎細(xì)胞癌和慢性淋巴細(xì)胞白血病中這種甲基化狀態(tài)也與蛋白質(zhì)表達(dá)的錯(cuò)誤相關(guān)，這表明DAPK的翻譯后調(diào)節(jié)在某些癌癥類型中尤為重要[14]。

1995年首次發(fā)現(xiàn)DAPK是干擾素-c(IFN-c)誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的介質(zhì)[15]。后來研究表明，DAPK-/-小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)由于p19ARF-p53途徑無法被激活而顯示出無法對癌基因如c-myc和E2F的過度表達(dá)的凋亡響應(yīng)；同時(shí)在Lewis肺癌細(xì)胞中，高度分化轉(zhuǎn)移的細(xì)胞增加了DAPK的表達(dá)，并且在這些細(xì)胞減少了DAPK的表達(dá)后便抑制了它們在小鼠肺部轉(zhuǎn)移遷移的能力[16]。以上研究結(jié)果均表明DAPK對于抑制早期癌癥發(fā)展中的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和晚期癌癥轉(zhuǎn)移是非常重要的。本研究證明，人食管鱗癌組織DAPK的陽性率及陽性區(qū)域面積明顯高于癌旁正常組織，同時(shí)在轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞中同樣高表達(dá)，并且轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞細(xì)胞遷移率及細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯升高，這與上述文獻(xiàn)研究結(jié)果一致并表明在食管鱗癌組織中DAPK亦呈現(xiàn)高表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了人食管鱗癌組織中DAPK的高表達(dá)，DAPK能促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。這表明DAPK同樣參與食管癌組織的病理生理過程，同時(shí)調(diào)節(jié)DAPK的異常表達(dá)將可能為食管癌的臨床治療及預(yù)后提供新的思路和尋找新的靶點(diǎn)。