香葉醇聯(lián)合對(duì)丙基苯甲醛抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖作用及機(jī)制研究

付薛艷，黃羽靜，王 玲，楊 揚(yáng)，2△

(1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541000； 2.廣西肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004)

肝癌是第五大常見(jiàn)的癌癥，病死率排名全球第三。目前，治療早期肝癌的首選方法是手術(shù)切除，術(shù)后生存率較高，但是許多肝癌患者在確診時(shí)已是晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī)，只能依賴(lài)化療或放療等治療方式[1]?；熀头暖煻际怯兄吒弊饔玫姆椒ǎ瑢?duì)身體損害很大。因此，開(kāi)發(fā)高效、低毒的抗肝癌藥物仍是目前的一個(gè)研究焦點(diǎn)。長(zhǎng)期以來(lái)，中草藥具有毒副作用小、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，用于腫瘤的治療越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注和認(rèn)可[2]。

草果為姜科豆蔻屬多年生草本植物草果的干燥果實(shí)，分布于中國(guó)云南、廣西、貴州等地，具有燥濕除寒、祛痰截瘧、健脾開(kāi)胃、利水消腫的功能。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)草果揮發(fā)油具有體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用[3-4]，且通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)確證了其能夠誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡，但目前對(duì)其抗肝癌作用的有效成分及作用方式尚不清楚。因此本課題以HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象初步研究了其主要成分香葉醇和對(duì)丙基苯甲醛的抗肝癌活性及作用方式，為揭示草果揮發(fā)油抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖抗肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 香葉醇、對(duì)丙基苯甲醛均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞由桂林醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)粉末、雙抗、胰酶、PBS均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DMEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMSO購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；6孔板、96孔板、培養(yǎng)皿均購(gòu)自廣州JET-BIOFIL公司；培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

1.2儀器 潔凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；分選型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences公司)；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO-15PC日本三洋)；恒溫水浴鍋(金壇恒豐儀器廠)；微量振蕩器(江蘇泰縣醫(yī)療器械廠)；離心機(jī)(上海安婷科學(xué)儀器廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥(重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(南寧市精密儀器儀表有限公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 將肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清1%雙抗(即100 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL青霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[5]。

1.3.2MTT法 單獨(dú)用藥：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞制備成每毫升5×104個(gè)的單細(xì)胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞培養(yǎng)板放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至50%～60%時(shí)，吸除舊培養(yǎng)液[6]，每孔單獨(dú)加入100 μL含香葉醇(終濃度為90、100、110、120 μg/mL)或?qū)Ρ郊兹?終濃度為90、110、130、150 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)液處理HepG2細(xì)胞；用等量的DMSO加入未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞作為對(duì)照組；不含細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)液作為空白組。培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL的MTT，4 h后棄去原培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，于微量振蕩器上振蕩約20 min至結(jié)晶溶解均勻[7]；用酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)板在波長(zhǎng)490 nm處的光密度值(OD值)，計(jì)算抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=[1-(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)] ×100%[8]。聯(lián)合用藥：分別聯(lián)合不同濃度的香葉醇(終濃度90、100、110、120 μg/mL)和對(duì)丙基苯甲醛(終濃度90、110、130、150 μg/mL)處理HepG2細(xì)胞；用等量的DMSO加入未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞作為對(duì)照組；不含細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)液作為空白組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用金正均法[9]計(jì)算兩藥協(xié)同作用的指數(shù)Q值，Q=EAB/(EA+EB-EA×EB)，判斷兩藥相互作用的性質(zhì)[10]。EA、EB為單獨(dú)用藥所得到的抑制率，EAB為聯(lián)合用藥所得到的抑制率。當(dāng)Q為0.85～1.15時(shí)，兩藥聯(lián)合使用表現(xiàn)為簡(jiǎn)單的相加作用；當(dāng)Q>1.15時(shí)，聯(lián)合用藥才具有協(xié)同作用；當(dāng)Q<0.85時(shí)，聯(lián)合用藥表現(xiàn)為拮抗作用。

1.3.3AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%～80%，吸除舊培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度香葉醇(終濃度為80、120 μg/mL)、對(duì)丙基苯甲醛(終濃度為80、120 μg/mL)及香葉醇聯(lián)合對(duì)丙基苯甲醛的培養(yǎng)液處理24 h，將培養(yǎng)液吸到15 mL離心管內(nèi)(含懸浮凋亡壞死細(xì)胞)，用冷PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入0.5 mL的胰酶消化液(不含EDTA)消化6 min，然后加入之前收集的細(xì)胞培養(yǎng)液0.5 mL，輕輕吹打均勻，轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄去上清液，收集細(xì)胞，用1 mL冷 PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)(細(xì)胞數(shù)量不少于5×104個(gè))，然后1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入300 μL 的1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞,5 μL的Annexin V-FITC混勻，避光，室溫孵育15 min,加入5 μL的PI染色，上機(jī)前補(bǔ)加200 μL的1×Binding Buffer，30 min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1單獨(dú)用藥 90、100、110、120 μg/mL香葉醇單獨(dú)作用于HepG2細(xì)胞增殖的抑制率分別為(2.33±0.22)%、(3.25±0.08)%、(9.23±0.06)%、(12.00±0.26)%，90、110、130、150 μg/mL對(duì)丙基苯甲醛單獨(dú)作用于HepG2細(xì)胞增殖的抑制率分別為(6.86±0.23)%、(12.86±0.18)%、(14.43±0.30)%、(26.49±0.50)%，香葉醇和對(duì)丙基苯甲醛均對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有一定的抑制作用。

2.2聯(lián)合用藥 聯(lián)合用藥處理HepG2細(xì)胞的抑制率較單獨(dú)用藥組明顯提高(P<0.05)，均表現(xiàn)出協(xié)同作用，見(jiàn)表1、2。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞用不同濃度的香葉醇、對(duì)丙基苯甲醛單獨(dú)處理和聯(lián)合應(yīng)用處理后，利用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。香葉醇濃度為80～120 μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞凋亡率為7.94%～9.69%；對(duì)丙基苯甲醛濃度為80～120 μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞凋亡率為5.35%～5.60%；當(dāng)香葉醇聯(lián)合對(duì)丙基苯甲醛時(shí)，HepG2細(xì)胞凋亡率為19.24%～39.48%。與對(duì)照組比較，單獨(dú)用藥組促進(jìn)了肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡，聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組相比促凋亡能力更明顯，見(jiàn)圖1。

表1 不同濃度聯(lián)合用藥作用于HepG2細(xì)胞的抑制率

表2 不同濃度聯(lián)合用藥作用于HepG2細(xì)胞的協(xié)同作用

A：對(duì)照組；B：80 μg/mL香葉醇組；C:80 μg/mL對(duì)丙基苯甲醛組;D:120 μg/mL香葉醇組;E:120 μg/mL對(duì)丙基苯甲醛組;F:80 μg/mL香葉醇聯(lián)合80 μg/mL對(duì)丙基苯甲醛組;G:80 μg/mL香葉醇聯(lián)合120 μg/mL對(duì)丙基苯甲醛組;H:120 μg/mL香葉醇聯(lián)合80 μg/mL對(duì)丙基苯甲醛組;I:120 μg/mL香葉醇聯(lián)合120 μg/mL對(duì)丙基苯甲醛組

圖1各組細(xì)胞凋亡率

3 討 論

肝癌是一個(gè)世界性的健康問(wèn)題，起病較隱匿，病程較短，病死率高，是當(dāng)前世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，尤其是在亞洲、非洲和歐洲南部，其發(fā)病率位居全球腫瘤疾病的第7位，病死率更是高居第3位[11]。肝癌的致癌過(guò)程非常復(fù)雜，由病毒、化學(xué)致癌物等諸多因素引起的肝細(xì)胞生長(zhǎng)失控而導(dǎo)致的癌變，經(jīng)歷啟動(dòng)-促進(jìn)-演變等多個(gè)階段的發(fā)病過(guò)程，與多種基因的調(diào)控和表達(dá)密切相關(guān)。目前肝癌的致病機(jī)制尚未研究清楚，療效亦不確切。中國(guó)是肝癌高發(fā)地區(qū)，其生存率較低，對(duì)生命健康的危害極大[12-14]。長(zhǎng)期以來(lái)，中醫(yī)藥治療肝癌不斷向前發(fā)展，其在改善癥狀、減輕痛苦、延緩進(jìn)程、延長(zhǎng)生命期限方面發(fā)揮著越來(lái)越大的作用，臨床與實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了多種中藥的抗癌作用，為肝癌的治療開(kāi)辟了新的空間[13]。中醫(yī)藥在減輕化療、放療的毒副作用，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力，提高患者的生存質(zhì)量方面均有明顯的效果，是治療肝癌的一種非常重要的方法[15-16]。香葉醇和對(duì)丙基苯甲醛是草果揮發(fā)油中最主要的成分，前期大量研究發(fā)現(xiàn)，香葉醇抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激，減輕血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)，從而抗動(dòng)脈粥樣硬化；調(diào)節(jié)血膽固醇、三酰甘油代謝紊亂和抗多種腫瘤細(xì)胞增殖等作用[15]。但目前苯甲醛類(lèi)物質(zhì)的藥理研究比較少見(jiàn)，暫無(wú)對(duì)丙基苯甲醛抗腫瘤的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選用草果揮發(fā)油中最主要的成分香葉醇及對(duì)丙基苯甲醛作為研究對(duì)象，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究其抗肝癌作用及其作用方式。結(jié)果顯示，香葉醇和對(duì)丙基苯甲醛單用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用，但不明顯。兩種藥物聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用明顯優(yōu)于單獨(dú)用藥，說(shuō)明二者的作用方式很可能不是單獨(dú)作用，而是通過(guò)協(xié)同來(lái)達(dá)到抑制的效果。同時(shí)證明這種協(xié)同作用是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這為草果揮發(fā)油的進(jìn)一步應(yīng)用提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究?jī)H局限于體外實(shí)驗(yàn)，草果揮發(fā)油誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具體作用的有效成分還需要進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。