七氟烷經(jīng)不同途徑吹入對(duì)體外循環(huán)犬肺組織呼吸功能和Caspase-3表達(dá)的影響

竇雪嬌，陳 松，張 紅△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，貴州遵義 563000；2.貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563000)

體外循環(huán)轉(zhuǎn)流過(guò)程中麻醉醫(yī)生或者體外循環(huán)灌注師會(huì)在不同的方式下給予多種麻醉藥物及調(diào)節(jié)血管活性、酸堿度的藥物，這種給藥方式目前尚缺乏統(tǒng)一性和規(guī)范性，不同給予方式是否會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同影響鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文研究揮發(fā)性麻醉藥七氟烷經(jīng)膜式氧合器與氣管插管兩種途徑吹入，探討其對(duì)犬肺組織呼吸功能和細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步指導(dǎo)七氟烷在臨床體外循環(huán)過(guò)程中的使用。

表1 各組實(shí)驗(yàn)犬不同時(shí)間點(diǎn)呼吸參數(shù)的變化

a:P<0.05，與T1時(shí)點(diǎn)比較；b:P<0.05，與T2時(shí)點(diǎn)比較；c:P>0.05，與C組比較

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雜種犬18只(由遵義醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量10～15 kg，雌雄不限，分為3組，每組6只。3組均開胸建立犬體外循環(huán)，左肺制造缺血再灌注模型，開放左肺門即刻經(jīng)不同途徑吹入七氟烷;C組未做操作，Ⅰ組經(jīng)氣管插管吹入七氟烷，Ⅱ組經(jīng)膜肺吹入七氟烷。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 用乳酸林格氏液及羥乙基淀粉預(yù)充體外循環(huán)管道及希健嬰兒型膜式氧合器(西安西京公司)，充分排氣后連接WEL-1000HA人工心肺機(jī)(天津匯康醫(yī)用設(shè)備有限公司)待用。3組犬均用2.5%戊巴比妥鈉25 mg/kg腹腔注射麻醉后固定，行雙腔氣管插管并機(jī)械通氣，潮氣量12～15 mL/kg，呼吸頻率每分鐘16次，I∶E=1∶2。監(jiān)測(cè)ECG、舌黏膜氧飽和度，行股動(dòng)靜脈切開置管分別監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓(MAP)和中心靜脈壓(CVP)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)步驟 待犬生命體征相對(duì)穩(wěn)定后，于正中開胸并切開心包暴露心臟，靜脈注射肝素3 mg/kg，待肝素化后行鎖骨下動(dòng)脈和右心耳插管，分別連接體外循環(huán)管道后分離左肺動(dòng)靜脈，待激活全血凝固時(shí)間(ACT)大于480 s后開始體外循環(huán)，10 min后阻斷左肺動(dòng)靜脈，同時(shí)行右側(cè)單肺通氣，調(diào)整呼吸參數(shù)(潮氣量8～10 mL/kg，呼吸頻率每分鐘20～22次)。阻斷左肺動(dòng)脈60 min后，開放左肺動(dòng)靜脈，并恢復(fù)雙肺機(jī)械通氣，繼續(xù)轉(zhuǎn)機(jī)30 min后停止體外循環(huán)，建立左肺體外循環(huán)缺血再灌注損傷模型。用魚精蛋白中和肝素，同時(shí)用腎上腺素0.01～0.3 μg·kg-1·min-1和多巴胺2～10 μg·kg-1·min-1靜脈泵入，經(jīng)股靜脈輸入回收的機(jī)血以維持循環(huán)穩(wěn)定2 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中采用常溫體外循環(huán)，術(shù)中維持灌注流量在100～120 mL·kg-1·min-1，平均動(dòng)脈壓維持在50～80 mm Hg，術(shù)中通過(guò)動(dòng)脈血?dú)夥治龅慕Y(jié)果調(diào)整酸堿及電解質(zhì)平衡。Ⅰ、Ⅱ組于開放左肺動(dòng)靜脈即刻分別經(jīng)氣管插管及膜肺吹入七氟烷持續(xù)30 min，調(diào)節(jié)七氟烷呼氣末濃度為2%。

1.2.3標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 3組犬分別于體外循環(huán)前(T1)、開放左肺動(dòng)靜脈后即刻(T2)、停機(jī)后2 h(T3)取左肺組織及股動(dòng)脈血行血?dú)夥治?i-stat血?dú)夥治鰞x)。根據(jù)血?dú)夥治龅慕Y(jié)果計(jì)算呼吸指數(shù)(RI)和氧合指數(shù)(OI)，RI=P(A-a)O2/PaO2，OI=PaO2/FiO2，其中P(A-a)O2=(Pa-PH2O)×FiO2-PaO2-PaCO2，Pa為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下大氣壓760 mm Hg，PH2O為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下飽和水蒸氣壓47 mm Hg，F(xiàn)iO2(%)為99%的吸入氧濃度。取出的肺組織一部分保存于甲醛中，用HE染色制作病理切片，光鏡下觀察組織病理變化；另一部分用Western blot檢測(cè)組織中活化Caspase-3的表達(dá)；并用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況，光鏡下觀察切片染色情況，正常細(xì)胞呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜呈棕黃色。選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)即為凋亡指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1各組犬呼吸參數(shù)的變化 隨時(shí)間推移3組犬OI逐漸降低，而RI逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在T3時(shí)點(diǎn)，Ⅰ、Ⅱ兩組與C組比較，OI明顯升高，RI明顯降低(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ兩組RI、OI比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2各組犬肺組織光鏡情況 T1時(shí)3組犬左肺組織的結(jié)構(gòu)正常。開放左肺動(dòng)靜脈后犬肺組織結(jié)構(gòu)清晰，但肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)較多炎性細(xì)胞、紅細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)肺泡間質(zhì)局部輕度增寬。T3時(shí)C組犬肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)肺泡腔塌陷及肺泡壁斷裂，炎性細(xì)胞、紅細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅰ、Ⅱ組犬肺組織結(jié)構(gòu)稍紊亂，有少量炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

2.3各組犬肺組織活化Caspase-3表達(dá)情況 T1時(shí)3組犬活化Caspase-3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，隨時(shí)間推移活化Caspase-3表達(dá)逐漸增加(P<0.05)。T3時(shí)點(diǎn)Ⅰ、Ⅱ兩組活化Caspase-3表達(dá)明顯低于C組(P<0.05)，Ⅰ組與Ⅱ組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2、圖2。

2.4各組犬肺組織細(xì)胞凋亡情況 隨時(shí)間推移3組犬肺組織凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性積分逐漸增加(P<0.05)。在T3時(shí)點(diǎn)，Ⅰ、Ⅱ組與C組比較，肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)，Ⅰ組與Ⅱ組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3、圖3。

A:C組；B：Ⅰ組；C：Ⅱ組

圖1 T3時(shí)點(diǎn)各組犬肺組織HE染色(×400)

a:P<0.05，與T1時(shí)點(diǎn)比較；b:P<0.05，與T2時(shí)點(diǎn)比較；c:P>0.05，與C組比較

圖2 各組犬肺組織活化Caspase-3表達(dá)情況

組別T1T2T3C組5.53±0.2715.41±0.23a47.19±0.32abⅠ組6.42±0.2318.90±0.12a27.08±0.21abcⅡ組7.11±0.1816.09±0.30a25.01±0.33abc

a:P<0.05，與T1時(shí)點(diǎn)比較；b:P<0.05，與T2時(shí)點(diǎn)比較；c:P>0.05，與C組比較

A:C組；B：Ⅰ組；C：Ⅱ組

圖3 T3時(shí)點(diǎn)各組犬肺組織細(xì)胞凋亡情況(×400)

3 討 論

七氟烷因其血/氣分配系數(shù)低，脂溶性低，麻醉誘導(dǎo)蘇醒速度快，對(duì)呼吸道刺激小并有較好的血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)在臨床工作中得到廣泛應(yīng)用。有研究報(bào)道，七氟烷預(yù)處理可以增加單肺通氣患者HO-1的表達(dá)，保護(hù)肺組織，減輕氧化應(yīng)激損傷[1]。在豬自體肺移植模型中，運(yùn)用七氟烷預(yù)處理可減輕豬因肺缺血再灌注損傷導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減少白細(xì)胞趨化因子表達(dá)[2]。CHO等[3]在瓣膜置換術(shù)中預(yù)先給以七氟烷，抑制了體外循環(huán)患者全身和肺部的炎性反應(yīng)，對(duì)早期肺部損傷有保護(hù)作用。根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用2%七氟烷吸入30 min后處理，可以減輕體外循環(huán)犬肺缺血再灌注導(dǎo)致的肺損傷[4]，這可能與七氟烷通過(guò)PI3K/AKT/NF-κB途徑降低肺組織細(xì)胞凋亡有關(guān)。

OI是衡量肺氧合功能的指標(biāo)，與肺功能呈正相關(guān)。RI指數(shù)是反映肺換氣功能的指標(biāo)，RI>1表示肺換氣功能明顯減退，與肺功能呈負(fù)相關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體外循環(huán)后3組犬RI指數(shù)逐漸升高，OI指數(shù)逐漸降低，T3時(shí)點(diǎn)光鏡下見(jiàn)肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡腔塌陷，大量炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)。Ⅰ、Ⅱ組與C組比較，T3時(shí)點(diǎn)RI降低，OI升高；Ⅰ、Ⅱ組RI、OI比較無(wú)差異，光鏡下可見(jiàn)肺組織結(jié)構(gòu)部分紊亂，有少量炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)。這說(shuō)明，體外循環(huán)可導(dǎo)致犬肺組織損傷，呼吸功能受損，吹入七氟烷后可降低肺組織損傷的程度，改善體外循環(huán)犬肺呼吸功能。

幾乎所有體外循環(huán)患者術(shù)后均有不同程度的急性肺損傷或肺功能障礙，約2%的成人患者發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征甚至急性呼吸衰竭，病死率高達(dá)15%～72%[6]。其機(jī)制主要是全身炎癥反應(yīng)綜合征和肺缺血再灌注損傷。體外循環(huán)中超氧離子、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)及補(bǔ)體等直接參與肺損傷。氧化應(yīng)激過(guò)度和缺血再灌注損傷后Ca2+超載等均可以誘導(dǎo)線粒體內(nèi)、外膜之間的線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔發(fā)生不可逆地過(guò)度開放，線粒體跨膜電位崩解，呼吸鏈解偶聯(lián)，線粒體基質(zhì)滲透壓升高，內(nèi)膜腫脹，位于線粒體膜間隙的細(xì)胞色素C(Cytc)等促凋亡活性蛋白釋放至胞質(zhì)內(nèi)，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終使Caspase-3活化，細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程[7]?；钚訡aspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白酶，是多種凋亡途徑共同的下游效應(yīng)部分，作用底物大多是細(xì)胞中的功能蛋白質(zhì)，它們參與DNA修復(fù)、mRNA裂解、類固醇合成及細(xì)胞骨架重建等過(guò)程[8]。研究發(fā)現(xiàn)，JAK2基因敲除的肝癌細(xì)胞，通過(guò)激活Caspase-3和其他信號(hào)通路，使肝癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和自我吞噬作用[9]；吸入2.4%七氟烷60 min，對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可能與增加海馬組織TREK-2表達(dá)、減少Caspase-3表達(dá)有關(guān)[10]。WANG等[11]研究表明,七氟烷通過(guò)降低Caspase-3、Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)的角度減輕LPS導(dǎo)致的急性肺損傷[12]。本實(shí)驗(yàn)研究表明：體外循環(huán)后活化Caspase-3表達(dá)逐漸升高，凋亡指數(shù)同時(shí)也升高；給予七氟烷后活化Caspase-3表達(dá)降低，凋亡指數(shù)也降低，且犬肺呼吸功能和肺組織損傷程度得到一定改善。有文獻(xiàn)報(bào)道，七氟烷可以通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)釋放、減輕內(nèi)毒素、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載及中性粒細(xì)胞聚集等多環(huán)節(jié)達(dá)到肺保護(hù)作用[13]。體外循環(huán)期間，Ca2+超載是肺缺血再灌注損傷發(fā)生的重要機(jī)制，KOJIMA等[14]的研究認(rèn)為，七氟烷可以通過(guò)阻斷多個(gè)Ca2+通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白減少心肌損傷。吸入麻醉藥不僅可以抑制氣管平滑肌肌漿網(wǎng)中Ca2+的滲漏，還可以抑制Ca2+滲漏引發(fā)的Ca2+內(nèi)流。所以，七氟烷減輕體外循環(huán)犬肺缺血再灌注損傷可能與七氟烷抑制減少Caspase-3活化表達(dá)、降低肺組織細(xì)胞凋亡有關(guān)。

體外循環(huán)的本質(zhì)是一種改良的人工心肺機(jī)，最核心的部分是膜肺和泵，起到人工肺和心的作用。血液通過(guò)膜肺吸收氧氣，排出二氧化碳，經(jīng)過(guò)氣體交換的血，在泵的推動(dòng)下重新回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。膜肺的主要材料是聚丙烯中空纖維膜，表面有很多微孔，允許氣體通過(guò)而不允許血漿通過(guò)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)膜肺和氣管插管兩種不同途徑吹入七氟烷發(fā)現(xiàn)：活化Caspase-3的表達(dá)降低程度和凋亡指數(shù)并無(wú)差異。吸入麻醉藥是通過(guò)血流分布全身，根據(jù)血液灌注程度不同，藥物與血流豐富的組織在10 min左右可迅速達(dá)到平衡，藥物最終在血液循環(huán)的推動(dòng)下至中樞神經(jīng)系統(tǒng)而產(chǎn)生麻醉效應(yīng)[15]。故在體外循環(huán)中不論是從氣管插管還是從膜肺吹入七氟烷，對(duì)肺組織產(chǎn)生的保護(hù)作用大致相同。

膜式氧合器是一種人工肺，通過(guò)人工合成的高分子材料制備的生物膜進(jìn)行氣體交換氧合，是集儲(chǔ)血、過(guò)濾、氧合、變溫、回收血等功能于一體的人工臟器。雖然它的材料與正常肺組織完全不同，但是七氟烷從不同途徑進(jìn)入體內(nèi)后對(duì)左肺組織呼吸功能及細(xì)胞凋亡的影響無(wú)明顯差異，其具體機(jī)制可能與七氟烷均是溶解和彌散到血液當(dāng)中，隨血液循環(huán)到達(dá)全身相應(yīng)的靶器官而產(chǎn)生作用有關(guān)。

七氟烷可使體外循環(huán)犬肺組織活化Caspase-3表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡減少，具體調(diào)節(jié)機(jī)制不清，仍有待進(jìn)一步研究，且不同途徑吹入七氟烷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的麻醉效能是否相同仍是一個(gè)疑問(wèn)。