NLRC5對HepG2.2.15細胞中MHC-Ⅰ類分子的調(diào)節(jié)作用

秦 嬌，王文龍，盛云建，強 麗，吳 剛

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,四川瀘州 646000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染后引起的免疫應(yīng)答是肝細胞損傷及炎癥發(fā)生的主要機制，而炎癥反復(fù)存在是慢性乙型肝炎進展為肝硬化甚至肝癌的重要因素。在HBV感染期間，HBV特異性T細胞的數(shù)量和功能與HBV控制情況有關(guān)[1]。因此，HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)不能有效清除感染HBV的細胞是造成乙型肝炎慢性化甚至肝癌的重要因素。經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子(MHC-Ⅰ類分子)通過提呈抗原肽而激活T淋巴細胞，CD8+CTL識別MHC-Ⅰ類分子提呈的內(nèi)源性抗原肽，參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在肝母細胞癌實驗中發(fā)現(xiàn)HBV感染可下調(diào)MHC-Ⅰ類分子HLA-ABC、HLA-E和MICA的表達[2]。

肽聚糖的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族(NLRs家族)是細胞內(nèi)模式識別受體(PRR)中一個很大的蛋白家族。NLRC5蛋白作為NLRs家族成員之一，近年多項研究表明，在天然免疫及適應(yīng)性免疫起重要作用。NLRC5蛋白可參與MHC-Ⅰ基因及其相關(guān)基因的調(diào)節(jié)，如β2-微球蛋白、Tap1和Lmp2基因的表達[3-4]。而NLRC5對HBV感染后所致的MHC-Ⅰ下調(diào)是否起作用，目前尚未見相關(guān)報道。Hep G2.2.15細胞是Hep G2細胞的衍生系，可持續(xù)、穩(wěn)定地釋放HBV。筆者將NLRC5能否誘導(dǎo)MHC-Ⅰ類分子表達增加的調(diào)控機制應(yīng)用于Hep G2.2.15細胞，觀察NLRC5在Hep G2.2.15細胞中對MHC-Ⅰ類分子表達的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1細胞及材料 Hep G2細胞株由本實驗室保存，Hep G2.2.15細胞由重慶醫(yī)科大學(xué)肝研所贈予，復(fù)蘇、培養(yǎng)至細胞呈對數(shù)期生長用于實驗。 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(美國Hyclone公司)；liprofectamineTM2000(美國Introvigen公司)、Opti-MEM (美國Gibco公司)。pc DNA3.1質(zhì)粒購自中國質(zhì)粒菌株基因庫；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根公司)；PCR引物由上海Invitrogrn生物公司合成。 Anti-NLRC5(一抗)、山羊抗兔二抗(HRP,英國Abcam公司)。FITC標(biāo)記鼠抗人HLA-ABC抗體(美國eBioscience公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組 A組：Hep G2組，B組：Hep G2+IFN-γ(5 ng/mL)組，C組：Hep G2.2.15組，D組：Hep G2.2.15+IFN-γ(5 ng/mL)組，E組：Hep G2.2.15+pcDNA3.1-NLRC5-GFP；F組：Hep G2.2.15 + pcDNA3.1組。

1.2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 待細胞數(shù)量達80%時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，將250 μL Opti-MEM與30 μL的 liprofectamineTM2000混合后靜置20 min，分別將pcDNA3.1-NLRC5-GFP、pcDNA3.1加入混有轉(zhuǎn)染劑的培養(yǎng)基中靜置10 min。加入3每毫升×106細胞懸液，混勻后置于培養(yǎng)箱中，6 h后換液。

1.2.3RT-PCR 從細胞中提取細胞總RNA。取 0.5 μg RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，逆轉(zhuǎn)錄原液稀釋10倍，將試劑及樣本cDNA混勻，放入定量PCR儀，并按下列條件進行cDNA擴增反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸25 s，共40個循環(huán)。所有樣本均設(shè)置3個平行管。

1.2.4Western blot 收集細胞進行蛋白提取，配置濃度為0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，根據(jù)BCA法測定各樣品的蛋白濃度，然后進行SDS-PAGE電泳，分別以60 V電泳濃縮膠、120 V電泳分離膠。選用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入(1∶3 500)，室溫下孵育2 h；用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.5流式細胞學(xué)檢測 取對數(shù)生長的細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，調(diào)定濃度為每毫升1×106個，將細胞用2 μL/mL的CFSE在37 ℃染色30 min，洗滌2次，以 FITC標(biāo)記的鼠抗人HLA-ABC抗體室溫孵育10 min，使用流式細胞儀進行檢測，每個抗體重復(fù)3次，記錄激發(fā)波長488 nm處綠色熒光。

2 結(jié) 果

2.1HBV對NLRC5轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達影響 與Hep G2組相比，Hep G2.2.15組細胞中的NLRC5轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平均下降(P<0.05)，見圖1。

圖1 HBV對NLRC5轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達影響

2.2IFN-γ對NLRC5轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達影響 Hep G2細胞加入IFN-γ后，NLRC5的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平均增加(P<0.05)，Hep G2.2.15細胞在IFN-γ刺激后不能提高NLRC5的蛋白表達水平，見圖2。

圖2 IFN-γ對NLRC5轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達影響

2.3HBV對MHC-Ⅰ類分子表達的影響 與Hep G2細胞相比，Hep G2.2.15細胞中的MHC-Ⅰ類分子的表達水平降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 HBV對MHC-Ⅰ類分子表達的影響

2.4轉(zhuǎn)染NLRC5蛋白后Hep G2.2.15細胞的表達情況 轉(zhuǎn)染NLRC5后的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平均增加(P<0.05)，見圖4。

2.5MHC-Ⅰ類分子在穩(wěn)定表達NLCR5的Hep G2.2.15細胞表面的表達情況 C組、E組、F組的MHC-Ⅰ類分子MFI分別為16.17、17.86、16.59。與未轉(zhuǎn)染組相比，過表達NLRC5蛋白后的Hep G2.2.15細胞表面的MHC-Ⅰ類分子表達上調(diào)(P<0.05)，見圖5。

圖4 轉(zhuǎn)染NLRC5蛋白后Hep G2.2.15細胞的表達情況

圖5 MHC-Ⅰ類分子在穩(wěn)定表達NLCR5的Hep G2.2.15細胞表面的表達情況

3 討 論

病原相關(guān)分子模式(PAMP)作為先天免疫反應(yīng)的第一道防御入侵微生物的防線，其識別依賴于幾類PRR。NLRC5蛋白作為NLRs家族成員之一，近年來廣泛在天然免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答、抗感染、腫瘤等領(lǐng)域被研究。NLRC5具有非典型NLRs結(jié)構(gòu)，即位于中心的腺苷酸三磷酸酶結(jié)構(gòu)域、位于N端的效應(yīng)器控制域(CARD 屬于死亡折疊域)，與NLRs其他家族成員的CARD或PYD沒有同源性，為非典型的CARD結(jié)構(gòu)域及位于C端最長的亮氨酸重復(fù)序列區(qū)域(LRR結(jié)構(gòu))[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)，NLRC5廣泛表達于人體多個組織，而免疫相關(guān)組織，如骨髓造血組織、淋巴結(jié)、脾和外周血淋巴細胞中NLRC5的表達最高[9]，表明NLRC5參與免疫應(yīng)答過程。NLRC5表達被TLR3配體[poly(I∶C)]、病毒感染或IFN-γ觸發(fā)[7,10-11]。HBV是一種雙鏈DNA病毒，在本實驗中發(fā)現(xiàn)，在HBV感染后的肝細胞中可發(fā)現(xiàn)NLRC5表達，表明NLRC5在HBV感染機體后引起的免疫應(yīng)答過程中起著一定的作用，可能參與了HBV的清除作用。IFN-γ是一種主要由Th1細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞、巨噬細胞等免疫細胞分泌的細胞因子，IFN-γ可通過刺激JAK-STAT信號、途徑激活NLRC5基因表達[12]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)的IFN-γ-NLRC5-MHC-Ⅰ軸對于CD8+T細胞應(yīng)答和細胞內(nèi)病原體的有效殺傷至關(guān)重要[13]。本實驗用等量的IFN-γ分別刺激Hep G2細胞和Hep G2.2.15細胞后得到NLRC5在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均呈上升趨勢。

筆者發(fā)現(xiàn)經(jīng)典MHC-Ⅰ類分子表達在Hep G2.2.15細胞中低于Hep G2細胞，Hep G2.2.15細胞不僅具有Hep G2細胞生物學(xué)活性，同時又能夠持續(xù)、穩(wěn)定地分泌HBV，表明HBV感染機體情況下可下調(diào)MHC-Ⅰ類分子表達，這與文獻一致[2]。MHC-Ⅰ類分子分布于有核細胞表面，通過提呈抗原肽而激活CD8+T淋巴細胞，參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。HBV感染宿主細胞后，其表面MHC-Ⅰ類分子表達下調(diào)或丟失，因此在宿主細胞表面不易形成足夠的抗原肽-MHC分子復(fù)合物，導(dǎo)致機體出現(xiàn)免疫耐受。目前認為，HBV感染機體后誘導(dǎo)機體出現(xiàn)免疫耐受是導(dǎo)致乙型肝炎慢性化的重要因素[14]。HBV特異性免疫應(yīng)答在HBV清除過程中起重要作用，MHC-Ⅰ類分子限制性的CD8+CTL可誘導(dǎo)肝細胞凋亡，也可分泌IFN-γ，以非細胞裂解機制抑制其他肝細胞內(nèi)HBV基因復(fù)制和表達。慢性HBV感染患者的CTL免疫應(yīng)答能力減弱是HBV感染趨于慢性化的主要原因[15]。

盡管NLRC5在天然免疫應(yīng)答中的作用仍有爭議，但最近發(fā)現(xiàn)的MHC-Ⅰ類反式激活因子(CITA)也屬于NLR蛋白家族，并構(gòu)成MHC-Ⅰ類基因轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[16]。NLRC5作為MHC-Ⅰ類分子的反式激活因子，誘導(dǎo)經(jīng)典MHC-Ⅰ的表達(即HLA-A、HLA-B、HLA-C)，非經(jīng)典的Ⅰ類(即HLA-E、HLA-F，HLA-G)，β亞基(B2M)，免疫蛋白酶體組分(PSMB9，即LMP2)和肽轉(zhuǎn)運蛋白(TAP1)[17]。有研究團隊發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染NLRC5缺陷型小鼠，在體內(nèi)降低了MHC-Ⅰ類分子表達,CD8+T細胞功能受損及病毒滴度增加[18]。NLR家族成員NLRC5在各種類型的感染過程中調(diào)節(jié)MHC-Ⅰ的表達，但其在對HBV免疫中的作用尚未得到充分研究。為探求HBV感染機體時NLRC5能否刺激MHC-Ⅰ類分子表達，筆者將外源性NLRC5轉(zhuǎn)染到Hep G2.2.15細胞，經(jīng)RT-PCR及流式細胞術(shù)分別得到上調(diào)的MHC-Ⅰ類分子表達。表明在Hep G2.2.15細胞中，NLRC5可上調(diào)MHC-Ⅰ類分子表達，提出NLRC5對HBV感染的免疫應(yīng)答中起重要作用。

上述研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染后NLRC5蛋白和MHC-Ⅰ類分子表達均下調(diào)。HBV感染人體后可降低其抗原呈遞能力，從而逃逸免疫監(jiān)督，導(dǎo)致特異性CTL不能有效清除HBV，機體呈持續(xù)HBsAg、HBeAg陽性表現(xiàn)。HBV特異性CTL免疫殺傷效應(yīng)的降低可能與HBV感染后導(dǎo)致的NLRC5表達下調(diào)有關(guān)。在HepG2.2.15細胞中過表達NLRC5，證實了NLRC5可以上調(diào)HepG2.2.15細胞MHC-Ⅰ類分子表達，而MHC-Ⅰ類分子表達增加促進HBV特異性CTL更好地發(fā)揮免疫殺傷效應(yīng)，這對揭示乙型肝炎免疫耐受機制具有重要意義。因此，NLRC5是否通過MHC-Ⅰ類分子增強HBV特異性CD8+T淋巴細胞的免疫殺傷作用可進一步證實，從而為打破乙型肝炎免疫耐受提供理論依據(jù)。