結(jié)核分枝桿菌感染RAW264.7巨噬細(xì)胞MALAT1的表達(dá)及其作用研究

黃舒穎，張 誠(chéng)，黃自坤，羅 清，卿 城

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南昌 330006；2.江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，南昌 330052； 3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，南昌 330006；4南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌 330006； 5.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，南昌 330006)

結(jié)核感染嚴(yán)重威脅人類健康，是單一病原菌導(dǎo)致患者死亡最高的感染性疾病。世界衛(wèi)生組織公布的報(bào)告顯示，全球每年約有700萬新發(fā)病例，死亡人數(shù)高達(dá)200萬人[1]。當(dāng)前研究認(rèn)為，結(jié)核病與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)。結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染機(jī)體后主要寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi)，是典型的胞內(nèi)致病菌。當(dāng)機(jī)體免疫力強(qiáng)時(shí)，巨噬細(xì)胞免疫激活，可殺滅胞內(nèi)寄生的MTB；而人體免疫低下時(shí)，MTB可抑制巨噬細(xì)胞活化，長(zhǎng)期存活于巨噬細(xì)胞內(nèi)[2]。當(dāng)前的研究對(duì)MTB如何逃避免疫反應(yīng)尚未完全掌握，相關(guān)研究對(duì)未來結(jié)核病防控具有重要意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long-noncoding RNA,lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA分子，幾乎不具有蛋白編碼能力。研究證實(shí)lncRNA廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄剪切后可直接折疊成高級(jí)結(jié)構(gòu)，以 RNA的形式與蛋白、DNA或者RNA結(jié)合，對(duì)目標(biāo)靶分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)路后水平調(diào)控[3]。在免疫調(diào)控[4]、腫瘤生長(zhǎng)[5]、細(xì)胞代謝[6]等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。lncRNA人類肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)最先是在肺部腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，隨后證實(shí)其在膀胱癌、乳腺癌等腫瘤疾病中發(fā)揮重要作用[7]。近年來研究證實(shí)MALAT1參與了機(jī)體炎癥免疫過程，是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子。ZHAO等[8]研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激THP-1和RAW264.7巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi) MALAT1 表達(dá)升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1是通過調(diào)控核因子-κB(NF-κB)炎癥信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)表達(dá)。PUTHANVEETIL等[9]研究表明MALAT1可調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)。目前，有關(guān)MALAT1在RAW264.7巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫中的作用鮮見報(bào)道。本研究擬通過MTB感染RAW264.7巨噬細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)MALAT1、TNF-α mRNA表達(dá)，探討MALAT1在RAW264.7巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC 27294)在本實(shí)驗(yàn)室保存；RAW264.7巨噬細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞研究所)；DMSO、DMEM(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Trizol試劑、LipofectmineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；PCR引物(上海生工生物工程公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物TaKaRa公司)；siRNA干擾試劑(廣州銳博公司)。熒光定量PCR采用Applied Biosystems 7600系統(tǒng)(美國(guó)ABI公司)。其他所用試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1巨噬細(xì)胞感染MTB模型的建立 將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RAW264.7巨噬細(xì)胞加入24孔板培養(yǎng)(37 ℃、5%CO2)至細(xì)胞貼壁良好，H37Rv按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=5感染巨噬細(xì)胞，4 h后PBS清洗細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后Trizol法提取細(xì)胞總RNA。

1.2.2RT-qPCR 在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)(0、48 h)Trizol法分別提取細(xì)胞總RNA，具體實(shí)驗(yàn)步驟按試劑說明書進(jìn)行。RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞MALAT1、TNF-α mRNA表達(dá)情況，采用TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體的操作步驟、實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。TNF-α[10]：上游引物5′-CCC TCA CAC TCA GAT CAT CTT CT-3′，下游引物5′-GCT ACG ACG TGG GCT ACA G-3′；MALAT1[8]:上游引物5′-CAT GGC GGA ATT GCT GGT A-3′，下游引物5′-CTG CCA ACA GCA TAG CAG TA -3′；內(nèi)參基因GAPDH[8]:上游引物5′-TGG TGA AGC AGG CAT CTG AC-3′，下游引物5′- TGC TGT TGA AGT CGC AGG AG-3′。

1.2.3siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染 制備MALAT1 siRNA及control siRNA(siNC)，具體由上海Gene Pharma公司完成。siRNA引物序列[8]：上游引物5′- GCG GAA GCU GAU CUC CAA UTT -3′，下游引物：5′- AUU GGA GAU CAG CUU CCG CTT -3′。巨噬細(xì)胞分為空白對(duì)照組、siMALAT1轉(zhuǎn)染組及siNC轉(zhuǎn)染組。培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞貼壁良好后，將siMALAT1或siNC轉(zhuǎn)染，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染操作說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染4～6 h后更換完全培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞，Trizol提取細(xì)胞RNA，RT-qPCR檢測(cè)siRNA敲減效果。

1.2.4siMALAT1后TNF-α mRNA的表達(dá) siMALAT1后的巨噬細(xì)胞與H37Rv按MOI=5的比例對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染，48 h后RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)。

1.2.5siMALAT1后MTB殺菌功能 siMALAT1后的巨噬細(xì)胞與H37Rv按MOI=5的比例進(jìn)行感染，4 h后用PBS清洗細(xì)胞(H37Rv感染后0 h時(shí)間點(diǎn))。分別于H37Rv感染后0、72 h收集并裂解各組巨噬細(xì)胞，將裂解液進(jìn)行系列梯度稀釋后立即接種于含有 OADC的7H10固體培養(yǎng)基上，3～4周后進(jìn)行MTB菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1H37Rv感染巨噬細(xì)胞后MALAT1及TNF-α mRNA變化 RT-qPCR檢測(cè)顯示，感染后48 h細(xì)胞內(nèi)MALAT1和TNF-α mRNA表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)，見圖1。

圖1 H37Rv感染巨噬細(xì)胞后MALAT1和TNF-α mRNA表達(dá)情況

2.2MALAT1沉默后對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)影響 通過RNAi技術(shù)成功沉默巨噬細(xì)胞MALAT1表達(dá)，見圖2A。將該細(xì)胞感染H37Rv，沉默MALAT1后的巨噬細(xì)胞與siNC轉(zhuǎn)染組比較，TNF-α mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，見圖2B。

2.3MALAT1沉默對(duì)巨噬細(xì)胞抗H37Rv殺菌能力的影響 siMALAT1轉(zhuǎn)染組與siNC轉(zhuǎn)染組細(xì)胞荷菌量在0 h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在H37Rv感染72 h后，siMALAT1轉(zhuǎn)染組巨噬細(xì)胞內(nèi)H37Rv的存活率明顯減少(P<0.05)，見圖3。

圖3 siMALAT1對(duì)巨噬細(xì)胞清除結(jié)核菌能力的影響

3 討 論

隨著微生物學(xué)、分子生物學(xué)、藥物化學(xué)及醫(yī)學(xué)其他學(xué)科的進(jìn)步，人類在抗結(jié)核病治療方面取得了突破性的進(jìn)展，但至今仍未實(shí)現(xiàn)徹底治愈該病的能力。近年來隨著HIV流行、多耐藥結(jié)核菌的產(chǎn)生，對(duì)當(dāng)前的結(jié)核病治療提出了新的目標(biāo)。

結(jié)核菌是一種胞內(nèi)寄生微生物，作為結(jié)核菌主要宿主細(xì)胞的巨噬細(xì)胞在抗結(jié)核免疫過程中扮演重要角色。巨噬細(xì)胞可以直接吞噬和殺傷結(jié)核菌，同時(shí)也可提呈抗原以激發(fā)機(jī)體的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)核菌可通過阻止巨噬細(xì)胞吞噬體和溶酶體融合，抑制巨噬細(xì)胞活化等多重方式對(duì)抗巨噬細(xì)胞的殺菌作用，從而實(shí)現(xiàn)了在胞內(nèi)長(zhǎng)期存活，躲避機(jī)體免疫清除的目的[11-12]。因此，巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫過程在結(jié)核病的防控中具有重要的臨床及科研價(jià)值。

lncRNA曾經(jīng)被認(rèn)為是無用的轉(zhuǎn)錄分子，然而近年的研究徹底顛覆了人們以往的認(rèn)知，即lncRNA是一類具有重要調(diào)控功能的細(xì)胞分子。在免疫系統(tǒng)領(lǐng)域，lncRNA在巨噬細(xì)胞[13]、淋巴細(xì)胞[14]、樹突狀細(xì)胞[15]等免疫細(xì)胞的功能調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用。已有部分研究顯示，lncRNA與巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫反應(yīng)有關(guān)，例如lncRNA CD244可調(diào)控結(jié)核感染過程中CD8+T細(xì)胞IFN-γ和TNF-α分泌[16]。巨噬細(xì)胞沉默lncRNA MEG3可增強(qiáng)其對(duì)BCG清除能力[13]。這些研究認(rèn)為lncRNA在結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞后的細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

本研究選取了跟炎癥免疫密切相關(guān)lncRNA分子MALAT1，它最早在非小細(xì)胞肺癌研究中被發(fā)現(xiàn)，之后的大量研究發(fā)現(xiàn)該分子與炎性反應(yīng)密不可分。XU等[17]在對(duì)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)MALAT1可調(diào)控炎癥相關(guān)信號(hào)通路PI3K/Akt；ZHOU等[18]發(fā)現(xiàn)在口腔鱗癌中MALAT1可影響胞內(nèi)炎癥通路NF-κB活化。PUTHANVEETIL等[9]研究表明MALAT1可調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子TNF-α表達(dá)。也有研究證實(shí)MALAT1與巨噬細(xì)胞NF-κB炎癥通路活化有關(guān)[8]。由于結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞后會(huì)誘發(fā)一系列炎性反應(yīng)，筆者推測(cè)MALAT1可能參與了結(jié)核菌感染相關(guān)炎性反應(yīng)過程，且當(dāng)前尚未有MALAT1在H37Rv感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后表達(dá)及作用的相關(guān)研究。

本研究結(jié)果表明，H37RV感染會(huì)上調(diào)MALAT1在巨噬細(xì)胞中表達(dá)；與此同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)也上調(diào)。表明結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞迅速活化，促炎因子表達(dá)上調(diào)，這是免疫細(xì)胞啟動(dòng)免疫過程以殺傷結(jié)核菌的表現(xiàn)。鑒于MALAT1在炎性反應(yīng)中的調(diào)控作用，本文構(gòu)建了MALAT1沉默的巨噬細(xì)胞，之后再感染結(jié)核菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siMALAT1后可促進(jìn)巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)，即MALAT1表現(xiàn)出抑制炎性反應(yīng)的作用。進(jìn)一步細(xì)菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，siMALAT1后可明顯增強(qiáng)RAW264.7巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核菌的胞內(nèi)清除能力，充分表明了MALAT1積極參與了巨噬細(xì)胞感染結(jié)核菌后的免疫反應(yīng)過程。

綜上所述，本研究表明結(jié)核菌H37Rv感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)MALAT1和炎癥因子TNF-α mRNA，沉默MALAT1將增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核菌的清除能力，為結(jié)核病免疫治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。