輻照預(yù)處理輔助纖維素酶水解綠茶茶渣制備水溶性糖研究

金友蘭，劉 安，肖文軍,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

茶葉深加工主要是指以茶葉生產(chǎn)過程中的茶鮮葉、茶籽、茶樹修剪葉以及由其加工而來的半成品、成品或加工副產(chǎn)品等為原料，通過集成應(yīng)用生物化學(xué)、生物工程、分離純化工程、營(yíng)養(yǎng)與衛(wèi)生學(xué)與酶制劑等領(lǐng)域的先進(jìn)技術(shù)及加工工藝[1]。隨著茶葉深加工領(lǐng)域的不斷拓展, 無論是茶飲料、速溶茶或是茶多酚等功能成分的提取都會(huì)產(chǎn)生大量的茶渣[2]。目前茶葉深加工中提取分離的有效成分尚局限于約占茶葉干重35%的水溶性物質(zhì)[3]，而且在提取這些水溶性物質(zhì)的過程中，也僅能獲得其80%～90%的得率。茶葉中的不溶性多糖類物質(zhì)占茶葉干重的20%～25%，主要是纖維素、半纖維素、淀粉和果膠等。通過生物降解技術(shù)，使不溶性糖轉(zhuǎn)化為水溶性糖，并使水溶性糖得率最大化，是提高茶渣的綜合利用效率、避免因茶渣的丟棄而造成環(huán)境污染的重要發(fā)展方向。我國(guó)目前對(duì)于茶渣的研究仍處于初級(jí)階段，已有的研究集中在茶渣的成分分析、茶蛋白的初步提取及茶渣用作飼料、肥料等的研究[4]。

本試驗(yàn)采用的輻照處理，作為一種物理手段，可使纖維素聚合度下降、結(jié)構(gòu)松散、反應(yīng)可及度提高，具有處理時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、能耗低、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[5]。目前鮮見此類研究，為此探索輻照預(yù)處理輔助纖維素酶降解綠茶水提茶渣制備水溶性糖的可行性，對(duì)資源綜合利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶茶渣由湖南金農(nóng)生物資源股份有限公司提供；蒽酮、醋酸、醋酸鈉均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；纖維素酶（4×105U·g-1，其最佳作用pH值為4.8 左右，上海瑞永生物科技有限公司）；硫酸（80%，株洲市星空化玻有限責(zé)任公司）；WFJ-7200 型可見分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）；全溫培養(yǎng)搖床（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司）；恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 輻照處理

提前將原料分裝于玻璃瓶?jī)?nèi)，以60Co 為輻照源分別采用0 kGy、200 kGy、600 kGy、800 kGy、1000 kGy 和1200 kGy 的輻照劑量對(duì)其進(jìn)行輻照處理。輻照后的樣品封于鐵盒中，室溫下避光保存。

輻照后水提茶渣中還原糖提?。焊鞣Q取1.5 g經(jīng)上述劑量輻照后的茶渣放入10 mL離心管中，加入30 mL 的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，將離心管放入搖床，在50℃，130 r·min-1的條件下進(jìn)行振蕩，分別在反應(yīng)后的52 h、54 h、56 h、58 h和60 h 時(shí)吸取上清液1 mL，過膜后裝于2 mL離心管，制成待測(cè)液，分別測(cè)定其還原糖的含量。

1.2.2 茶渣酶解

分別稱取0.15 g、0.25 g、0.35 g 的纖維素酶于10 mL 離心管中，并做好標(biāo)記，加入30 mL的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和1.5 g 未經(jīng)輻照預(yù)處理的茶渣，蓋好后置于50 ℃、130 r/min 可控溫?fù)u床中進(jìn)行酶解，分別在反應(yīng)后的4 h、6 h、8 h、10 h、24 h、29 h、48 h、72 h 和96 h 時(shí)統(tǒng)一提取1 mL 茶液樣，測(cè)定其還原糖的含量。

分別稱取未經(jīng)輻照預(yù)處理的茶渣1.5 g 放入10 mL 離心管中，將離心管放入搖床，分別設(shè)置30℃、40℃、50℃、60℃，在130 r/min 的條件下進(jìn)行反應(yīng)，再統(tǒng)一對(duì)還原糖含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 輻照預(yù)處理輔助纖維素酶水解

茶渣經(jīng)不同劑量輻照處理后，分別稱取1.5 g 茶渣樣品加入已配有30 mL 緩沖液、0.25 g 纖維素酶的離心管中，于130 r/min、50℃的全溫培養(yǎng)搖床中進(jìn)行酶解反應(yīng)，分別于第52 h、54 h、56 h、58 h 和60 h 進(jìn)行取樣，統(tǒng)一進(jìn)行還原糖含量檢測(cè)。

1.2.4 還原糖測(cè)定分析

還原性糖含量：待測(cè)液經(jīng)適當(dāng)倍數(shù)稀釋后進(jìn)行采樣，用DNS 法對(duì)還原糖含量進(jìn)行測(cè)定[6-7]。測(cè)定方法與步驟：將茶渣還原糖稀釋適當(dāng)倍數(shù)后備用。吸取上述待測(cè)液后用超純水補(bǔ)至1 mL并加入4 mL DNS 試劑，同時(shí)以蒸餾水作空白對(duì)照，沸水浴顯色10 min，取出冷卻，以空白調(diào)零，在620 nm 處測(cè)定ABS值。

文中圖表均采用origin 制圖軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶對(duì)綠茶茶渣還原糖含量的影響

2.1.1 加酶量對(duì)茶渣還原糖含量的影響

在相同反步增加至0.35 g 時(shí)，還原糖產(chǎn)量水平與0.25 g 酶量的酶解效果相當(dāng)。由此可知，增加酶量有利于在相同酶解時(shí)間段內(nèi)的還原糖含量增加。當(dāng)酶量由0.15 g 增加至0.25 g 時(shí)，還原糖產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)酶量達(dá)到0.35 g 時(shí)，由于受到底物的限制，還原糖含量不再提高。從經(jīng)濟(jì)節(jié)約的角度來考慮，加酶量可采用0.25 g。酶量對(duì)茶渣還原糖含量的影響如圖1所示：

圖1 加酶量對(duì)還原糖含量的影響Fig.1 Effectof the amount of enzyme on the content of reducing sugar

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)茶渣還原糖含量的影響

在酶解過程的前29 h，還原糖產(chǎn)量上升趨勢(shì)較平緩，29 h～48 h 時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加，還原糖的產(chǎn)量快速提高，48 h 達(dá)到最高，還原糖含量為214.649 mg，48 h 后呈下降趨勢(shì)，96 h還原糖含量為153.847 mg。48 h 之后由于酶解時(shí)間過長(zhǎng)，底物和酶量均減少，故還原糖含量逐漸減少，因此最適酶解時(shí)間應(yīng)在48 h 左右，如圖2所示。

2.1.3 酶解溫度對(duì)茶渣還原糖含量的影響

隨著酶解溫度由30℃升高到50℃，還原糖含量明顯上升，說明此時(shí)溫度升高有利于酶解，而當(dāng)溫度進(jìn)一步升高至60℃時(shí)，對(duì)酶解反應(yīng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，導(dǎo)致還原糖產(chǎn)量大幅度下降，主要是因?yàn)檫^高的溫度使部分纖維素酶失活，由此可知纖維素的最佳酶解溫度在50℃左右。酶解溫度對(duì)茶渣還原糖含量的影響如圖3所示。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the content of reducing sugar

圖3 酶解溫度對(duì)還原糖含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the content of reducing sugar

2.2 輻照對(duì)綠茶茶渣還原糖含量的影響

隨著輻照劑量的增大，還原糖含量呈增加趨勢(shì)，當(dāng)采用1200 kGy 輻照處理，茶渣中的還原糖含量急劇增加，增加到98.610 mg/g，未經(jīng)輻照的綠茶茶渣還原糖含量?jī)H為9.611 mg/g，提高926.01%，該結(jié)果與何源祿等[8]研究結(jié)果一致。低劑量的輻照作用主要導(dǎo)致大分子聚合，高劑量的輻照作用會(huì)使物質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，使大分子降解為小分子物質(zhì)，由此可知高劑量輻照對(duì)纖維素有更加明顯的降解作用。輻照劑量對(duì)茶渣還原糖含量的影響如圖4所示。

圖4 輻照劑量對(duì)還原糖含量的影響Fig.4 Effect of irradiation dose on the content of reducing sugar

2.3 輻照預(yù)處理輔助纖維素酶水解對(duì)綠茶茶渣還原糖含量的影響

輻照處理能顯著提高茶渣酶解效率。圖5所示，對(duì)照樣品在纖維素酶作用60 h 后，其還原糖含量?jī)H為147.47 mg，而經(jīng)不同輻照劑量處理的茶渣還原糖含量顯著提高，較對(duì)照分別提高了1.2倍、1.2倍、1.5倍、1.5倍、1.3倍。在200～1200 kGy 劑量范圍內(nèi)，還原糖含量隨劑量增大而增加，經(jīng)800 kGy 輻照的茶渣和經(jīng)1000 kGy 輻照的茶渣還原糖含量都在220 mg 左右，1200 kGy 輻照的茶渣還原糖含量反而較1000 kGy 低，約為194.60 mg。

圖5 輻照-酶解對(duì)還原糖含量的影響Fig.5 Effects of irradiation and enzymatic hydrolysis on the content of reducing sugar

輻照預(yù)處理能提高茶渣酶解最開始的反應(yīng)速度。52 h 對(duì)照組的還原糖含量?jī)H為70.72 mg，而經(jīng)200 kGy、600 kGy、800 kGy、1000 kGy、1200 kGy 輻照后的茶渣還原糖含量分別為131.71 mg、143.86 mg、128.57 mg、209.90 mg和175.71 mg。如圖所示，輻照可以使酶解達(dá)到最大效率的時(shí)間縮短，800 kGy、1000 kGy 處理的茶渣反應(yīng)58 h 后接近其反應(yīng)60 h 時(shí)的水平，而1000 kGy 處理的茶渣則在56 h 時(shí)已經(jīng)達(dá)到其最大的還原糖生產(chǎn)量。由此可見輻照輔助纖維素酶降解工藝要優(yōu)于單獨(dú)輻照處理或者酶解處理工藝，輻照預(yù)處理輔助酶解有利于提高纖維素的轉(zhuǎn)化率。

3 討論

以綠茶茶渣纖維素制備還原性糖，由于纖維質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，纖維素酶無法與其接觸充分，酶解效率低且成本高。本試驗(yàn)采用輻照處理茶渣，使綠茶茶渣的主要組分物質(zhì)發(fā)生了變化，其中一部分纖維素被直接降解為糖，同時(shí)改變了綠茶茶渣復(fù)雜的纖維素結(jié)構(gòu)，增大了酶解反應(yīng)時(shí)的物質(zhì)接觸面積，從而茶渣中水溶性還原糖含量增加。未經(jīng)輻照預(yù)處理的對(duì)照處理茶渣還原糖含量?jī)H為9.611 mg/g，而經(jīng)1200 kGy 輻照處理的茶渣還原糖含量可以達(dá)到98.610 mg/g，提升926.01%，對(duì)照的還原糖含量達(dá)到最大值147.47 mg 需要60 h，而經(jīng)過最佳輻照劑量1000 kGy 處理的茶渣酶解56 h 就能達(dá)到最大還原糖含量。

一方面輻照作為一種便捷高效的清潔能源，應(yīng)用于纖維素材料的處理上，能有效提高轉(zhuǎn)化率，降低轉(zhuǎn)換成本。另一方面輻照處理也會(huì)對(duì)酶解反應(yīng)起抑制作用。因此，輻照劑量并非越大越理想，試驗(yàn)結(jié)果也表明經(jīng)800 kGy、1000 kGy 輻照處理的茶渣其反應(yīng)效率要大于1200 kGy 輻照處理的茶渣。同時(shí)本研究表明輔助纖維素酶降解茶渣制備水溶性糖的工藝可行，該工藝具有一定的行業(yè)實(shí)用價(jià)值。