圍術(shù)期長期血糖控制對(duì)糖尿病SD大鼠術(shù)后傷口愈合的對(duì)比研究

向川，蔡龍，梁智勇，李帥杰

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，山西 太原 030001)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一種因胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足或靶細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低引起的以糖代謝紊亂為主，嚴(yán)重威脅人類健康的代謝障礙性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球約有2.85億DM患者，預(yù)計(jì)2030年將達(dá)到4.39億人[1]。在DM的諸多并發(fā)癥中，傷口愈合能力受損是其中的一個(gè)典型并發(fā)癥。如果傷口愈合不良或遷延不愈，則可能會(huì)出現(xiàn)致殘，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。目前臨床中針對(duì)DM患者傷口不愈合的治療方法有很多，且獲得了較好的療效。但臨床工作中發(fā)現(xiàn)DM患者圍手術(shù)期圍術(shù)期內(nèi)控制血糖水平后，術(shù)后仍出現(xiàn)一部分傷口愈合不良的現(xiàn)象。這可能是因長期的高血糖引起機(jī)體血管損傷，從而引起組織缺氧缺血，特別是微血管損傷[3-5]。因此，為提高DM病人的生活質(zhì)量，血糖水平對(duì)術(shù)后傷口愈合的影響及其預(yù)防已成為如今探討的焦點(diǎn)和亟需解決的問題。

傷口愈合過程是一個(gè)多分子、多細(xì)胞共同參與、彼此間相互協(xié)調(diào)的復(fù)雜且精細(xì)的過程，正常的傷口愈合由四階段組成(凝血期、炎癥期、增生期、修復(fù)期)，它們連續(xù)發(fā)生并又相互交錯(cuò)，沒有明顯界線[6]?，F(xiàn)已有許多研究證明，DM傷口愈合中的重要特征是炎癥反應(yīng)的紊亂以及促炎因子的大量釋放和促傷口愈合因子的減少，最終致使傷口遷延不愈。炎癥分子會(huì)受到血糖的調(diào)節(jié)，白介素-6(interleukin，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)能夠明顯抑制傷口愈合，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，高血糖癥能夠增加炎癥介質(zhì)的釋放，從而抑制膠原沉積和形成，并誘導(dǎo)大量成纖維細(xì)胞凋亡，最終使傷口難以愈合[7-8]。

如今，血糖過高容易引起各種并發(fā)癥已達(dá)成共識(shí)，中華麻醉學(xué)分會(huì)指南指出，圍術(shù)期血糖降低到一定水平，可以有效降低手術(shù)及麻醉風(fēng)險(xiǎn)[9]。但也有研究者發(fā)現(xiàn)，雖然圍術(shù)期降低血糖水平能夠有效降低傷口感染和不愈合的發(fā)生率，但臨床工作中仍有部分患者傷口出現(xiàn)不愈合的現(xiàn)象?；诖耍角笱强刂茣r(shí)間對(duì)局部傷口的影響具有現(xiàn)實(shí)的意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 2月齡健康雄性SD大鼠，180～200g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、ELISA試劑盒、兔抗F4/80單克隆抗體和山羊抗TNF-α多克隆抗體、兔抗熱休克蛋白47(heat-shock protein 47，HSP47)多克隆抗體均購自Bioword。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝。

1.3 主要方法

1.3.1 DM大鼠傷口模型建立 2月齡健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周禁食(不禁水)16 h后，一次性腹腔注射STZ進(jìn)行造模，劑量60 mg/kg。STZ臨用前用pH值為4.4、濃度為0.1 mmol/L的檸檬酸緩沖液配成2%STZ溶液。0.1 mol/L檸檬酸緩沖液調(diào)配：檸檬酸2.1 g、雙蒸水100 mL、檸檬酸鈉2.94 g、雙蒸水100 mL，檸檬酸與檸檬酸鈉溶液按1.3︰1比例混合均勻，用NaOH調(diào)pH值至4.4，高溫高壓滅菌，4℃冷藏備用。注射STZ 72 h后，尾靜脈取血，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L確認(rèn)為DM大鼠動(dòng)物模型。穩(wěn)定4周喂養(yǎng)后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組情況造模。以1.5%戊巴比妥鈉(45 mL/kg)腹腔注射麻醉，15 min后將大鼠麻醉后俯臥于手術(shù)板上，四肢固定，背部剃毛，75%酒精常規(guī)消毒；用打孔器在大鼠背部鎖骨下0.5 cm的背中線兩側(cè)分別打一圓孔，深達(dá)皮下筋膜層，直徑0.5 cm。手術(shù)完畢后輔料敷貼固定。

1.3.2 動(dòng)物分組 a)對(duì)照組A組：正常血糖SD大鼠按上述方法制作傷口模型作為對(duì)照，分別于造模后第1天、第3天、第7天、第14天(每個(gè)時(shí)間段3只)心臟取血并處死大鼠，提取創(chuàng)口樣本。b)實(shí)驗(yàn)組：按上述方法制作DM模型，傷口造模前以及造模后均給予中效胰島素(魚干精蛋白鋅胰島素)皮下注射，4～8 U/d。根據(jù)血糖情況調(diào)整用量，每天分1～2次注射，控制隨機(jī)血糖在13 mmol/L以下。將實(shí)驗(yàn)組分為B組：術(shù)前血糖控制1 d；C組：術(shù)前血糖控制3 d；D組：術(shù)前血糖控制7 d；E組：術(shù)前血糖控制1個(gè)月。在相同部位制作相同大小的傷口，分別于相同時(shí)點(diǎn)采取標(biāo)本。

1.3.3 傷口愈合的形態(tài)學(xué)分析 a)計(jì)算機(jī)分析傷口愈合大體圖像，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。傷口愈合率(%)=(傷口初始面積-傷口形成后第n天的面積)/創(chuàng)面初始面積×100%；b)提取傷口樣本并制作石蠟切片，常規(guī)HE染色，觀察傷口的組織學(xué)變化。

1.3.4 ELISA檢測(cè) a)標(biāo)本的采取、收集和保存：SD大鼠心臟采血，離心1 500 rpm，15 min。取上清液，-80℃保存。b)試劑的準(zhǔn)備：從冰箱中取出試劑盒，降至與室溫平衡后使用，自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測(cè)量校正。蒸餾水或去離子水應(yīng)為新鮮高質(zhì)量的。c)加樣：4次加樣步驟(標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)本、酶結(jié)合物、底物)，加樣時(shí)注意不要濺出，不產(chǎn)生氣泡，應(yīng)加于酶標(biāo)板底部。d)保溫：塑料封貼紙封蓋，水育箱中25℃溫育。e)洗滌：ELISA就是靠洗滌實(shí)現(xiàn)分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌。f)顯色和比色：采用酶標(biāo)比色儀，測(cè)定吸光度OD值(A460 nm)。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色 a)組織切片進(jìn)行脫蠟、水化，滴加3% H2O2室溫孵育10 min。b)5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉1 h。c)滴加兔抗F4/80單抗體(稀釋度1∶100)或兔抗HSP47多抗體(稀釋度1∶400)，在保濕盒內(nèi)4℃孵育過夜；d)PBS洗滌切片，于存在生物素標(biāo)記的IgG保濕盒內(nèi)孵育0.5 h；e)滴加SP試劑，保濕盒內(nèi)孵育1 h；f)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。染色過程中陰性對(duì)照中的Ⅰ抗體為PBS。g)光學(xué)顯微鏡(×400)下每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選擇10個(gè)損傷區(qū)視野，計(jì)算陽性染色細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 DM大鼠傷口愈合形態(tài)學(xué)分析

2.1.1 傷口愈合率 糖尿病大鼠血糖控制組與正常對(duì)照組相比，從傷口造模后的第1天開始，傷口愈合率即出現(xiàn)明顯差異性(40.44% vs 52.89%)，且發(fā)現(xiàn)圍術(shù)期內(nèi)血糖控制組的愈合率低于長期血糖控制組；在傷口造模后的第14天，實(shí)驗(yàn)組中圍術(shù)期內(nèi)嚴(yán)格控制血糖的DM大鼠創(chuàng)面均未完全愈合，而正常對(duì)照組大鼠(A組)和長期血糖控制組大鼠(E組)傷口都已基本完全愈合。且隨著術(shù)前血糖控制的時(shí)間越長，傷口愈合率會(huì)逐漸增加(見圖1)。

2.1.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 a)正常組SD大鼠：皮膚進(jìn)行切創(chuàng)造模后，切口愈合的初始階段(第1～3天)即可看到切口已有大量的炎性細(xì)胞浸潤，且在切創(chuàng)后的第7天左右，炎性細(xì)胞開始減少，但成纖維樣細(xì)胞明顯增多，且組織內(nèi)并可見大量的新生毛細(xì)血管，這些結(jié)構(gòu)共同組成新鮮肉芽組織，隨后由于間質(zhì)細(xì)胞增多，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轳：劢M織，達(dá)到傷口愈合。見圖2。b)圍術(shù)期內(nèi)控制血糖SD大鼠組(即B、C、D組)：切創(chuàng)后的SD大鼠，雖然術(shù)前血糖得到了短期的控制，但在切口愈合的初始階段，皮膚愈合過程出現(xiàn)了紊亂，炎性細(xì)胞浸潤程度明顯低于正常組，但在術(shù)后的第5～7天左右，此時(shí)的炎性細(xì)胞大量浸潤，其內(nèi)只可見散在的少部分成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管。見圖2。c)長期血糖控制SD大鼠組：由于切創(chuàng)造模前已給予長期的血糖控制，在切口愈合初期，部分炎性細(xì)胞浸潤，且于愈合中期階段，炎性細(xì)胞浸潤程度較圍術(shù)期內(nèi)控制血糖組有改善，經(jīng)過長期降糖，切口愈合過程后期有許多成纖維細(xì)胞及新生毛細(xì)血管生成，共同形成肉芽組織，隨后向瘢痕組織逐漸轉(zhuǎn)變(見圖2)

2.2 ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6水平

2.2.1 ELISA檢測(cè)血清中TNF-α含量結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，糖尿病大鼠組于切創(chuàng)造模后切口愈合的初始階段起，血清中TNF-α的水平均明顯增高，表現(xiàn)為高炎癥反應(yīng)(P<0.05)；在術(shù)后切口愈合的中期階段，實(shí)驗(yàn)組SD大鼠血清的TNF-α水平均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但正常組TNF-α水平開始升高，且相比于圍術(shù)期血糖控制組和長期血糖控制組，有明顯差異性(P<0.05)；在切口愈合第14天，與圍術(shù)期控制血糖組相比，正常組血清中TNF-α水平明顯增高(P<0.05)，但和長期血糖控制組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.2.2 ELISA檢測(cè)血清中IL-6含量結(jié)果 與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠組于切創(chuàng)造模后切口愈合的整個(gè)階段內(nèi)，血清中IL-6的水平均明顯增高，表現(xiàn)為高炎癥反應(yīng)；在術(shù)后切口愈合的后期階段，切口愈合的第14天，與圍術(shù)期控制血糖組相比，正常組血清中IL-6的水平明顯較低(P<0.05)，但和長期血糖控制組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.3 傷口愈合過程中巨噬細(xì)胞浸潤特點(diǎn)

2.3.1 免疫組化檢測(cè)傷口局部巨噬細(xì)胞浸潤程度結(jié)果 實(shí)驗(yàn)采用F4/80免疫標(biāo)記巨噬細(xì)胞并染色后觀察到，與正常對(duì)照組相比，圍術(shù)期控制血糖組切口組織愈合初期階段巨噬細(xì)胞明顯偏低(P<0.05)，在切口愈合的中后期階段，巨噬細(xì)胞浸潤明顯增多，表現(xiàn)為一種高炎癥反應(yīng)(P<0.05)。但與正常對(duì)照組相比，長期控制血糖組巨噬細(xì)胞浸潤仍有增高傾向，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.3.2 檢測(cè)成纖維細(xì)胞數(shù)量結(jié)果 成纖維細(xì)胞修復(fù)軟組織損傷，與周圍新生毛細(xì)血管形成肉芽組織多發(fā)生于傷口愈合的中后期階段，所以本研究中采用HSP47抗體免疫標(biāo)記成纖維細(xì)胞觀察第7天(見圖3)以及第14天發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，圍術(shù)期控制血糖組切口組織內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)量均偏低(P<0.05)，但與圍術(shù)期控制血糖組相比，長期控制血糖組切口組織內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)量有所增加(P<0.05)，并且與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

圖1 不同時(shí)間段內(nèi)各組SD大鼠傷口愈合情況

圖2 不同時(shí)間段內(nèi)各組SD大鼠切口皮膚局部組織HE染色情況(×200，比例尺10 μm)

組 別術(shù)后第1天術(shù)后第3天術(shù)后第7天術(shù)后第14天A 組40.754 87±1.468 2242.845 86±0.824 3244.652 43±1.925 9367.758 33±1.955 94B 組57.275 77±0.553 0862.285 07±2.420 1657.585 35±1.990 5261.350 64±2.096 46C 組58.895 07±0.647 4467.429 39±1.582 6257.398 18±1.165 1057.643 98±1.906 17D 組55.623 64±0.708 1161.099 13±1.682 4956.396 43±1.787 0758.739 75±2.559 47E 組49.517 71±2.502 8254.037 38±2.502 8251.604 37±0.836 6355.825 72±5.213 97

表2 不同時(shí)間內(nèi)各組大鼠血清中IL-6水平比較

表3 各組SD大鼠在傷口愈合不同階段切口局部巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量的比較

3 討 論

正常傷口愈合過程中需要適度的炎癥反應(yīng)來促進(jìn)膠原蛋白以及肉芽組織的生成，但是DM傷口易出現(xiàn)愈合困難的現(xiàn)象，這可能是因高血糖反應(yīng)引起的的炎癥反應(yīng)紊亂所致。傷口愈合過程中局部浸潤的巨噬細(xì)胞會(huì)釋放許多的促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6等)，啟動(dòng)傷口修復(fù)的進(jìn)程。巨噬細(xì)胞作為清道夫可吞噬、清除細(xì)菌和壞死組織，避免感染的發(fā)生[10]。但DM會(huì)發(fā)生持續(xù)性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致促炎因子的過度釋放，抑制傷口愈合。有研究報(bào)道稱，DM可以引起TNF-α以及IL-6的分泌增多，從而抑制膠原沉積并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的凋亡，不利于傷口的愈合[8]，而系統(tǒng)的降低血糖或TNF-α可顯著促進(jìn)傷口的愈合[11-12]。

圖3 各組SD大鼠在術(shù)后第7天時(shí)的切口局部成纖維細(xì)胞表現(xiàn)(×400，比例尺20 μm)

組 別術(shù)后第7天術(shù)后第14天A 組213.7±1.5154.3±2.1B 組111.0±1.0105.0±2.6C 組173.3±2.1135.3±3.5D 組176.7±2.3137.7±2.1E 組213.3±5.5154.3±3.2

本研究通過與對(duì)照組相比較后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中DM大鼠的傷口愈合均出現(xiàn)了延遲，且傷口愈合程度與術(shù)前血糖控制時(shí)間的長短相關(guān)。術(shù)前血糖控制時(shí)間越長，傷口越易愈合。研究還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組在傷口造模后的前期(第1～3天)較對(duì)照組局部巨噬細(xì)胞浸潤較少，但血清中TNF-α、IL-6的含量很高，表現(xiàn)為高炎癥狀態(tài)。在傷口愈合的中、后期，正常組炎癥因子開始升高，但此時(shí)實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，此種炎癥反應(yīng)的紊亂抑制了各階段的傷口愈合過程。實(shí)驗(yàn)組內(nèi)相比較發(fā)現(xiàn)，術(shù)前控制血糖時(shí)間越長，傷口愈合的前期巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞浸潤發(fā)生時(shí)間和數(shù)量越趨近正常組，越有助于傷口的愈合。而且術(shù)前血糖控制時(shí)間最長的大鼠，血清中TNF-α、IL-6的含量明顯偏低，這可能降低了中期成纖維細(xì)胞凋亡的發(fā)生，最終促進(jìn)傷口的愈合。這說明術(shù)前控制血糖時(shí)間與傷口愈合呈正相關(guān)，此外這這或許還可以說明臨床中為什么DM患者圍術(shù)期內(nèi)經(jīng)合理的控制血糖后仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)傷口不愈合或愈合困難的現(xiàn)象，但其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究去證實(shí)。