裂解系統(tǒng)在細菌載體疫苗中的應(yīng)用

唐一波，劉青，李沛，羅紅艷，孔慶科

西南大學(xué) 動物科技學(xué)院，重慶 400715

疫苗接種是預(yù)防和控制人和動物傳染病傳播和流行的一種重要手段，傳統(tǒng)疫苗如滅活疫苗和弱毒疫苗由于存在生產(chǎn)工藝限制、毒力回復(fù)和需多次免疫等弊端，逐漸呈現(xiàn)出被新型生物疫苗所取代的趨勢。近年來發(fā)展出了一種新型的重組活載體疫苗，它以減毒的活細菌或病毒作為載體將攜帶的外源保護性抗原或者重組到真核表達質(zhì)粒的外源核酸遞送至宿主細胞內(nèi)而發(fā)揮免疫作用[1-2]。活載體疫苗的出現(xiàn)也克服了亞單位疫苗免疫原性差和核酸疫苗接種用量大以及接種方式繁瑣等缺點[3-4]，逐漸受到了研究學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究。其中重組減毒沙門菌疫苗 (Recombinant attenuatedSalmonellavaccine，RASV) 因其可以誘導(dǎo)粘膜免疫、體液免疫和細胞免疫已經(jīng)被廣泛作為疫苗載體來遞送外源抗原和核酸疫苗，用于預(yù)防某些細菌、病毒、真菌的感染或治療某些癌癥[5-8]，其一些脂類成分還可以發(fā)揮佐劑的作用，制成的口服疫苗便于接種，成本較低，適用于大規(guī)模接種免疫。

部分血清型的沙門菌屬于細胞內(nèi)寄生菌，野生型和普通減毒型的沙門菌在進入宿主細胞內(nèi)繁殖到一定程度時，為避免被宿主免疫系統(tǒng)清除會釋放沙門菌囊泡 (Salmonellacontaining vacuole，SCV)[9-10]，誘導(dǎo)宿主細胞的焦亡/凋亡 (Pyroptosis/Apoptosis)。形成SCV后，疫苗菌株難以被宿主機體裂解，重組到載體疫苗的保護性抗原很難從菌株中釋放，進而難以被免疫細胞捕獲加工遞呈誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，降低了疫苗的免疫效果。此外，接種疫苗后的動物體內(nèi)殘留的沙門菌還可能在環(huán)境中進行傳播造成污染，這對于活細菌載體疫苗的生產(chǎn)應(yīng)用也是一大考驗。因此如何構(gòu)建一種自動裂解系統(tǒng)讓減毒沙門菌在體內(nèi)繁殖到一定程度而自發(fā)裂解菌體使外源核酸或保護性抗原能夠釋放到宿主細胞內(nèi)，并且盡可能在侵染過程中不誘導(dǎo)宿主細胞的焦亡/凋亡，最終在體內(nèi)檢測不到沙門菌的殘留并產(chǎn)生較好的體液、細胞和粘膜免疫效果成為了目前研究的難點。目前應(yīng)用的細菌裂解系統(tǒng)主要包括：基于調(diào)控延遲肽聚糖合成的裂解系統(tǒng)、基于噬菌體裂解蛋白調(diào)控的裂解系統(tǒng)、基于毒素-抗毒素系統(tǒng) (Toxin-antitoxin system)的裂解系統(tǒng)。文中將結(jié)合上述幾種裂解系統(tǒng)以及本實驗室正在構(gòu)建的基于細菌T6SS相關(guān)肽聚糖水解因子調(diào)控的沙門菌自動裂解系統(tǒng)等方面進行綜述，為重組細菌載體疫苗的應(yīng)用研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 基于調(diào)控延遲肽聚糖合成的裂解系統(tǒng)

該裂解系統(tǒng)是由Roy Curtiss Ⅲ[11-12]實驗室開發(fā)的一種基于抑制沙門菌細胞壁肽聚糖層合成的活疫苗裂解系統(tǒng)。二氨基庚二酸 (Diaminopimelic acid，DAP) 和胞壁酸 (Muramic acid) 是組成細菌細胞壁肽聚糖層必需的成分，asdA基因編碼一種合成DAP必不可少的酶，而murA基因編碼胞壁酸合成途徑的第1個酶[13]，二者的缺失將導(dǎo)致細菌無法合成細胞壁。Roy Curtiss Ⅲ團隊首先利用UK-1鼠傷寒沙門菌Salmonellatyphimurium構(gòu)建了asdA基因缺失株χ8276[11]，他們又在該菌株中引入了由araCPBAD啟動子調(diào)控asdA基因表達的重組質(zhì)粒pYA3530。araCPBAD依賴于阿拉伯糖(Arabinose) 的調(diào)控，在含有阿拉伯糖的培養(yǎng)基中菌株可以合成AraC蛋白，該蛋白可以激活啟動子PBAD進而調(diào)控asdA基因的表達，使ΔasdA菌株仍然能夠合成DAP維持完整的細胞壁結(jié)構(gòu)；而在缺少阿拉伯糖的條件下，質(zhì)粒上的asdA基因無法表達造成細菌細胞壁合成受阻而裂解死亡。在缺少阿拉伯糖的條件下，asdA基因殘留的轉(zhuǎn)錄水平依然能夠合成DAP，于是該研究團隊將pYA3530質(zhì)粒上asdA基因的起始密碼子ATG突變?yōu)镚TG以降低asdA基因的轉(zhuǎn)錄水平。

為達到組合asdA基因和murA基因的目的，Roy Curtiss Ⅲ團隊在PBAD和asdA基因間插入了一段起始密碼子優(yōu)化的murA基因形成了質(zhì)粒pYA3681。為了降低asdA基因和murA基因殘留的轉(zhuǎn)錄水平，他們在asdA基因末尾的3′端引入了來自P22噬菌體的啟動子PR來指導(dǎo)反義mRNA的合成，以此來關(guān)閉asdA基因和murA基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程。PR啟動子還會受到C2蛋白的阻遏，在C2蛋白存在的情況下PR的功能會受到抑制。他們將pYA3681引入到了具有ΔasdA突變的菌株χ8937中最終構(gòu)建了自動裂解菌株χ8937(pYA3681)。該菌株在阿拉伯糖存在的條件下會激活PBAD，啟動murA、asdA和c2的轉(zhuǎn)錄保證菌株正常合成細胞壁，產(chǎn)生的C2蛋白則會抑制P22 PR啟動子的功能；在缺少阿拉伯糖時，PBAD由于無法被激活造成murA、asdA和c2的轉(zhuǎn)錄受阻，Asd、MurA和C2蛋白無法繼續(xù)合成而隨著細胞分裂濃度降低，Asd和MurA蛋白的減少導(dǎo)致DAP和胞壁酸無法合成，菌株因無法產(chǎn)生細胞壁肽聚糖層而裂解，C2的減少激活了P22 PR啟動子形成反義mRNA阻遏Asd和MurA蛋白的合成。為了測試調(diào)控延遲裂解系統(tǒng)遞送抗原的效果，Roy CurtissⅢ團隊將攜帶有肺炎鏈球菌Rx1 PspA蛋白的調(diào)控延遲裂解沙門菌載體疫苗以口服的方式接種到小鼠體內(nèi)，結(jié)果小鼠產(chǎn)生了針對PspA和沙門菌外膜蛋白的抗體反應(yīng)，免疫21 d后檢測到宿主組織內(nèi)無疫苗細菌存在?；谡{(diào)控延遲肽聚糖合成的裂解系統(tǒng)的原理見圖1。

圖1 基于調(diào)控延遲肽聚糖合成的裂解系統(tǒng) (改編自文獻[11])Fig.1 The lysis system based on regulated delayed peptidoglycan synthesis (adapted from the reference [11]).(A)Map of plasmid pYA3681.(B) Diagram of model illustrating the regulatory interactions in the regulated delayed lysis system.If arabinose is present, arabinose will bind to AraC and the PBAD will be activated.If there is no arabinose, PBAD will not be activated.

Roy Curtiss Ⅲ團隊基于上述裂解載體，又構(gòu)建了一系列重組沙門菌疫苗載體去遞送其他抗原，以驗證疫苗在體內(nèi)的裂解效果和遞送抗原的免疫保護效果。Ameiss等[14]應(yīng)用上述構(gòu)建的延遲裂解沙門菌株去遞送攜帶有流感M2e抗原的土撥鼠肝炎病毒顆粒，結(jié)果表明具有延遲裂解表型的載體疫苗比不具有裂解表型的對照組載體疫苗產(chǎn)生了更好的免疫保護效果。Juárezrodríguez等[15]構(gòu)建了具有不同復(fù)制起始位點的pYA3681裂解載體質(zhì)粒的衍生質(zhì)粒，并將裂解質(zhì)粒和優(yōu)化的牛結(jié)核分枝桿菌抗原基因進行組合轉(zhuǎn)入RASVs中，結(jié)果構(gòu)建好的RASVs在口服免疫的小鼠體內(nèi)顯示了調(diào)控延遲裂解和延遲抗原合成的表型，產(chǎn)生了比對照組BCG疫苗更高水平的體液和細胞免疫應(yīng)答。Ashraf 等[16]構(gòu)建了攜帶有流感病毒NP抗原的調(diào)控延遲裂解RASV菌株χ11246 (pYA4858)，他們分別通過口腔、鼻腔和腹腔等不同途徑免疫小鼠，結(jié)果在小鼠上分別產(chǎn)生了針對致死性流感病毒rWSN株80% (口腔)、100% (鼻腔) 和100%(腹腔) 的保護效果，并且都激發(fā)了Th1型細胞免疫。2012年，Kong等[12]在原來延遲裂解載體的基礎(chǔ)上又構(gòu)建了一種具有編碼阿拉伯糖調(diào)控裂解表型和真核細胞表達質(zhì)粒的重組沙門菌DNA疫苗遞送載體，他們通過在真核表達質(zhì)粒中插入一段用于高效核酸轉(zhuǎn)運和基因表達的多重DNA核酸靶向序列，以及通過增加核酸酶抗性來保護質(zhì)粒免受宿主降解等方法提高了疫苗載體的遞送效果。他們將篩選出的具有最佳遺傳屬性的延遲裂解表型的沙門菌疫苗載體用于遞送編碼流感病毒W(wǎng)SN 株HA抗原的DNA疫苗，結(jié)果疫苗在免疫的小鼠中實現(xiàn)了對致死性流感病毒的完全保護效果，這為有效遞送DNA疫苗提供了一種新思路。此外，Zhang等[17]還將攜帶有禽流感病毒基因組的重組沙門裂解疫苗轉(zhuǎn)染至禽類細胞當(dāng)中，結(jié)果在從26個雞胚胎成纖維細胞 (CEF) 和Madin-Darby犬腎 (MDCK) 細胞共培養(yǎng)物中的11個細胞中回收到了高達107TCID50/mL 的甲型流感病毒，證明了延遲裂解疫苗載體可以遞送流感病毒基因組進入真核細胞內(nèi)進行表達產(chǎn)生完整的病毒結(jié)構(gòu)。雖然該沙門菌延遲裂解系統(tǒng)在遞送外源抗原和DNA疫苗進入真核細胞發(fā)揮免疫作用方面取得了不錯的效果，但其安全性和裂解效果還需進一步探索和完善。

2 基于噬菌體裂解蛋白調(diào)控的裂解系統(tǒng)

該系統(tǒng)是由細菌菌蛻 (Bacterial ghost，簡稱BG) 衍化而來的一種裂解系統(tǒng)。BG是一種無生命活性的細菌包膜復(fù)合體空殼結(jié)構(gòu)，它是由ΦX174噬菌體的裂解基因E在革蘭陰性菌中表達產(chǎn)生的E蛋白使細菌表面產(chǎn)生跨膜孔洞而形成的一種結(jié)構(gòu)[18-23]。E蛋白是一種膜蛋白，能夠寡聚化形成一個跨越細菌內(nèi)外膜的通道[21,24]，電鏡下顯示，E蛋白產(chǎn)生的特定通道與內(nèi)外膜融合在一起，密封了周質(zhì)空間。由于細胞內(nèi)的高滲透壓，包括DNA在內(nèi)的細胞質(zhì)內(nèi)容物從通道中排出留下了包膜復(fù)合體的空殼結(jié)構(gòu)[21,23-24]。但是BG空殼結(jié)構(gòu)仍然保持著類似天然細菌的細胞形態(tài)，整個細胞表面結(jié)構(gòu)包括外膜蛋白、粘附素、脂多糖 (LPS) 和肽聚糖層被保留[23]。一些小分子物質(zhì)可以在BG細胞內(nèi)存儲并從E蛋白裂解細胞形成的通道釋放出來，基于以上特性，BG現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展成為一種用于遞送保護性抗原、DNA疫苗以及某些藥物的載體工具[21,23]。由于BG表面仍然保留著低毒性的LPS，所以BG也用作佐劑或候選疫苗[23,25]。后來基于噬菌體相關(guān)裂解蛋白又發(fā)展出了一些用于調(diào)控活細菌疫苗的自動裂解系統(tǒng)。

在2009年，Zhang等[26]構(gòu)建了由Mg2+調(diào)控噬菌體裂解基因表達的自動裂解系統(tǒng)。在鼠傷寒沙門菌基因組中編碼mgtB基因的啟動子Pmgt是由Mg2+嚴謹調(diào)控的，在不含Mg2+離子的條件下該啟動子才會啟動表達。λ噬菌體的裂解基因由R基因 (編碼內(nèi)溶素水解細胞壁肽聚糖層)、S基因(編碼穿孔素攻擊細胞內(nèi)膜) 以及Rz1和Rz2基因(編碼裂解輔助因子) 組成[27]。Zhang等將野生型λ噬菌體裂解基因SRRZ連接到重組質(zhì)粒上，在SRRZ基因的上游引入了Pmgt啟動子，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌Escherichia coli內(nèi)進行表達。結(jié)果在不含Mg2+的培養(yǎng)基中，Pmgt-SRRZ組合造成了細菌的快速裂解；在外源性添加10 mmol/L Mg2+的培養(yǎng)基中細菌顯示出了和陰性對照組相似的生長曲線，說明該裂解系統(tǒng)受到Mg2+的嚴謹調(diào)控。在同一年，Liu和Curtiss[28]又報道了由Ni2+調(diào)控噬菌體裂解基因表達的裂解系統(tǒng)。鎳感應(yīng)/反應(yīng)信號系統(tǒng)能控制nrsBACD操縱子的表達[28-29]，在Ni2+存在條件下該操縱子才啟動表達。Liu將該系統(tǒng)與一系列噬菌體裂解基因進行組合后連接到了質(zhì)粒載體上，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至藍藻中表達。結(jié)果在外源性添加Ni2+的條件下裂解基因啟動表達合成裂解蛋白造成宿主細胞壁結(jié)構(gòu)的破壞。電鏡下顯示，分別在加入7.0 μmol/L的Ni2+6 h和12 h后藍藻細胞壁的厚度下降，并在24 h后形成BG。而Guan等[30]在霍亂弧菌Vibrio cholerae中找到了一種由Fe2+嚴謹調(diào)控的啟動子PviuB。PviuB受到Fur-Fe2+復(fù)合物的調(diào)控，在富含F(xiàn)e2+的條件下Fur-Fe2+復(fù)合物能夠結(jié)合到Fur盒上阻遏PviuB的轉(zhuǎn)錄，而在缺少Fe2+的環(huán)境中該啟動子正常表達[30-31]。他們將PviuB和ΦX174噬菌體裂解基因E融合到pUT質(zhì)粒載體上形成質(zhì)粒pUTaBE，并將pUTaBE轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3) 中。在富含F(xiàn)e2+的培養(yǎng)基中PviuB的轉(zhuǎn)錄受到抑制造成基因E的表達受阻，菌株正常生長并表達異源抗原；而在Fe2+限制的培養(yǎng)基中或在體內(nèi)環(huán)境時，PviuB正常啟動基因E的表達合成裂解蛋白E造成大腸埃希菌的裂解死亡形成BG，同時異源抗原會從BG中釋放出來發(fā)揮作用。由Fe2+調(diào)控的裂解系統(tǒng)見圖2。

這些由金屬離子調(diào)控噬菌體裂解基因表達的裂解系統(tǒng)雖然在體外試驗取得了不錯的裂解效果，但還需進一步完善體內(nèi)試驗來驗證它們的自發(fā)裂解效果。目前大多數(shù)遞送抗原、藥物或者DNA疫苗的方式還是通過表達E蛋白形成滅活的BG空殼來實現(xiàn)，而最近Won等[32]通過將λ噬菌體的穿孔素-內(nèi)溶素基因和ΦX174噬菌體的裂解E基因組合一起共同表達而提高了細菌的裂解效果，使產(chǎn)生的BG表面的細胞毒性降低并更易遞送外源性物質(zhì)，有著很好的應(yīng)用前景。

3 基于毒素-抗毒素系統(tǒng)的裂解系統(tǒng)

毒素-抗毒素系統(tǒng) (TAs) 廣泛存在于細菌中，它被認為是一種和細胞程序化死亡相關(guān)的系統(tǒng)[33-35]。該系統(tǒng)廣泛存在于細菌染色體和質(zhì)粒當(dāng)中，它由毒素蛋白和抗毒素蛋白兩部分組成[36-39]。通常毒素和抗毒素會在細菌體內(nèi)形成穩(wěn)定的復(fù)合體，但是當(dāng)外界環(huán)境改變給細菌帶來生長壓力時例如C、N等營養(yǎng)成分缺少，毒素蛋白就會從毒素-抗毒素系統(tǒng)中釋放出來造成細菌自身的中毒死亡或生長停滯，從而實現(xiàn)一種細胞程序化死亡調(diào)節(jié)機制[40]。例如，Nariya等[36]發(fā)現(xiàn)在黃色粘球菌Myxococcu xanthus中mazF基因編碼一種MazF毒素，而mrpC是一個潛在的抗MazF毒素基因。他們發(fā)現(xiàn)在粘球菌子實體形成期間MazF毒素會自動釋放強制性裂解細胞而有效地實現(xiàn)子實體和孢子的形成，MrpC蛋白可以中和剩余的MazF對處于其他生長期細胞的毒性作用。此外，細菌在受到噬菌體侵染時也會出現(xiàn)由TAs介導(dǎo)的“自殺”行為來裂解細菌[35]。例如，存在于歐文桿菌Erwinia carotovora中的ToxIN系統(tǒng)會在噬菌體侵入時自動釋放出ToxN毒素蛋白來抑制細菌自身的生長，防止噬菌體進一步繁殖和侵染[41]。當(dāng)然除了以上調(diào)控細胞程序化死亡之外，TA系統(tǒng)也參與DNA復(fù)制[42]、維持細胞膜完整性[43]以及細胞壁合成[44]等環(huán)節(jié)。

圖2 Fe2+調(diào)控的裂解系統(tǒng) (改編自文獻[30])Fig.2 The Fe2+-regulated lysis system (Fig.2 adapted from the reference [30]).(A) Map of plasmid pUTaBE.(B)Bacterial cells lysis and the heterologous antigen release caused by protein E.In iron-rich conditions, the Fe2+-Fur complex binds to the Fur box of PviuB and represses the transcription of the E gene.In iron-limiting conditions, the Fe2+-Fur complex is dissociated and the transcription of the E gene initiated.Bacterial cells are rapidly lysed by protein E to achieve the heterologous antigen release.

2011年Mutschler等[45]報道了一種和細菌細胞壁合成相關(guān)的TA系統(tǒng)造成細菌自動裂解的機制。他們發(fā)現(xiàn)在Epsilon-Zeta (ε-ζ) TA系統(tǒng)中，Zeta毒素或者是肺炎鏈球菌Streptococcus pneumonia中的Zeta毒素PezT能夠磷酸化合成肽聚糖的前體物質(zhì)UDP-N-乙酰葡萄糖胺 (UNAG)，磷酸化的UNAG-3P會積聚在細胞質(zhì)內(nèi)而抑制MurA蛋白的功能，MurA蛋白合成受到抑制導(dǎo)致胞壁酸無法合成進而肽聚糖合成受阻而造成細菌裂解。他們又將克隆出來的pezT基因轉(zhuǎn)入大腸埃希菌內(nèi)進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)30 min后電鏡下觀察到細菌中央部形成隆起，誘導(dǎo)1 h后細菌大量死亡，僅剩的一些完整細胞結(jié)構(gòu)的細菌也呈現(xiàn)出小尺寸形態(tài)和卵圓形形態(tài)，這些現(xiàn)象與細胞壁結(jié)構(gòu)受損有著密切關(guān)系。肺炎鏈球菌在受到環(huán)境壓力或者侵染宿主細胞的過程中可能激活自身的PezT毒素造成肺炎鏈球菌的裂解而釋放肺炎球菌溶血素(Pneumolysin)，這一現(xiàn)象可能與肺炎鏈球菌菌株的毒力增強有一定的聯(lián)系，但目前尚不清楚具體的機制與聯(lián)系[46-47]。肺炎鏈球菌PezT毒素造成的細菌裂解和肺炎鏈球菌溶血素釋放的模式圖見圖3。此外，還有一些學(xué)者認為降低UNAG的水平使細菌無法合成細胞壁的現(xiàn)象可能只是Zeta/PzaT毒素在面對生存壓力條件下表達的幾種形式之一[47-48]。最近，Rocker等[49]就報道了革蘭陰性菌淋球菌中zeta毒素基因ng_ζ1不僅能夠磷酸化UNAG，也能夠磷酸化UNAM (UDP-muramic acid，UDP-胞壁酸) 以及磷酸化UDP-葡萄糖。磷酸化的UNAM積聚在細胞質(zhì)內(nèi)能夠抑制MurC蛋白的活性從而抑制胞壁酸的合成。淋球菌通過ng_ζ1毒素抑制MurA和MurC合成的雙重作用來抑制自身細胞壁合成實現(xiàn)自動裂解調(diào)控自身生長的功能。此外，Zeta/PezT毒素不僅會激發(fā)細菌自身的裂解死亡，也有可能對感染的宿主細胞造成毒害作用[47]。Ng等[50]發(fā)現(xiàn)在真核微藻類的小球菌Chlorella vulgaris當(dāng)中表達的肺炎鏈球菌PezT毒素也導(dǎo)致了藻類細胞的損傷和裂解，該毒素可能也對哺乳動物的細胞有著潛在的毒性，但還沒有試驗證實這一點。

根據(jù)抗毒素的性質(zhì)和活性，目前已經(jīng)有超過100種的TAs被鑒定和歸類，它們總共被分為六大類 (Ⅰ型–Ⅵ型)[38]。雖然TAs廣泛存在于細菌當(dāng)中，但還有許多TAs沒有被人們發(fā)現(xiàn)，即使對已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的這些TAs來說其部分功能可能還未鑒定，對于TAs能否在細菌載體疫苗中運用以及其安全性還有待進一步探索。

圖3 肺炎鏈球菌PezT毒素造成細菌裂解的模式圖 (改編自文獻[45])Fig.3 Model diagram of bacterial lysis caused by the pneumococcal PezT toxin (adapted from the reference [45]).Stress conditions lead to release of the UNAG kinase PezT via degradation of the antitoxin PezA.PezT converts UNAG to UNAG-3P, which leads to inhibition of peptidoglycan synthesis.The rapidly dividing cells will undergo lysis, and the cytosolic pneumolysin will be released from these lysed cells.

4 基于細菌T6SS的裂解系統(tǒng)

4.1 T6SS結(jié)構(gòu)及肽聚糖水解效應(yīng)因子

Ⅵ型分泌系統(tǒng) (T6SS) 是革蘭氏陰性細菌的一種獨特分泌方式，在25%的革蘭氏陰性細菌中都發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基因簇[51]。T6SS是一種類似T4噬菌體尖狀尾部的細胞穿刺裝置，它通過接觸-依賴的方式刺入到受體細胞內(nèi)并釋放相應(yīng)的效應(yīng)蛋白而發(fā)揮作用[52-54]。隨著近幾年的深入研究，T6SS的結(jié)構(gòu)逐漸被科學(xué)家們揭示出來。T6SS其實是一種納米收縮鞘裝置，它由跨膜復(fù)合物、基底和鞘-管復(fù)合體三部分組成[55-57]?？缒?fù)合物和基底由一系列蛋白質(zhì)組成[58-59]，基底用作連接跨膜復(fù)合物和鞘-管復(fù)合體的平臺[60]，鞘-管復(fù)合體的管狀部分由HCP蛋白 (溶血素共調(diào)節(jié)蛋白) 構(gòu)成，VipA和VipB等結(jié)構(gòu)蛋白圍繞HCP管形成鞘狀結(jié)構(gòu)[61-63]。由VgrG三聚體蛋白和PAAR蛋白組成的尖狀復(fù)合物位于HCP管的尖端[54,64]，而一些效應(yīng)因子 (Effector) 通過非共價鍵的方式結(jié)合到了這些尖狀復(fù)合物上。具有T6SS裝置的細菌通過直接接觸宿主細胞或者競爭菌將收縮鞘裝置刺入受體細胞內(nèi)，進而釋放相應(yīng)的效應(yīng)因子對受體細胞造成損傷[65-68]。T6SS裝置的結(jié)構(gòu)示意圖見圖4。

最早關(guān)于T6SS相關(guān)效應(yīng)因子功能的報道起始于Tse (Type six exported) 蛋白家族的研究。Hood等[68]首先在銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaHCP分泌毒力島-1編碼的T6SS(H1-T6SS) 中鑒定出了3種嚴謹翻譯后調(diào)控的毒力分泌蛋白Tse1–3，同時有3種同源免疫蛋白Tsi1–3 (Type six immuned 1–3) 伴隨這3種毒力蛋白產(chǎn)生。他們發(fā)現(xiàn)在大腸埃希菌和真核細胞質(zhì)中表達的Tse2蛋白都對細胞的生長起著明顯的抑制作用，而細胞質(zhì)中的免疫蛋白Tsi2可以中和Tse2毒性防止銅綠假單胞菌自身中毒。后來Russell等[69]在Nature上報道了銅綠假單胞菌能夠借助接觸-依賴性的T6SS方式分泌Tse1和Tse3進入到受體細菌的周質(zhì)空間中，造成受體菌的裂解死亡。通過液相色譜和質(zhì)譜分析二者純化產(chǎn)物，他們發(fā)現(xiàn)Tse1能切割肽聚糖肽鏈中的酰胺鍵以及肽鏈殘基中的γ-D-谷氨?；?L-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸鍵(γ-D-glutamyl-L-meso-diaminopimelic acid bond，D-Glu-m-DAP)，Tse3 能切割乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid，MurNAc) 和N-乙酰氨基葡萄糖 (N-acetylglucosamine，GlcNAc) 殘基之間的碳骨架，二者能夠破壞細菌細胞壁肽聚糖層。Tse1和Tse3不會進入供體菌自身的周質(zhì)空間中表達，而是在細胞質(zhì)內(nèi)表達后通過T6SS的跨膜裝置轉(zhuǎn)運到受體菌的周質(zhì)空間發(fā)揮作用，而存在于供體菌周質(zhì)空間的免疫蛋白Tsi1和Tsi3可以中和供體菌間彼此接觸時釋放的Tse1和Tse3的毒性，防止自身中毒。Russell 研究團隊在大腸埃希菌中分別誘導(dǎo)表達了周質(zhì)空間定位的Peri-Tse1和Peri-Tse2，分別在5 h和6 h后檢測不到活菌，電鏡下觀察到細胞膨大變形裂解，說明Tse1和Tse3具有破壞細菌細胞壁結(jié)構(gòu)造成細菌裂解死亡的功能。Tse1、Tse2和Tse3從供體菌遞送至受體菌的機制見圖4。

圖4 銅綠假單胞菌T6SS效應(yīng)因子的遞送機制 (改編自文獻[69])Fig.4 The mechanism of delivery of T6SS effectors from P. aeruginosa (adapted from the reference [69]).P. aeruginosa delivers the Tse effector proteins to adjacent recipient cell through a T6SS device, and the recipient cell will lyse due to lack of the Tsi proteins.Effectors and immunity proteins are shown as circles and rounded rectangles, respectively.

除了Tse1和Tse3之外，研究學(xué)者陸續(xù)還發(fā)現(xiàn)了一些其他能夠水解細胞壁肽聚糖層的效應(yīng)因子。具有酰胺酶活性的Tae (Tae1–Tae4) 蛋白超家族[70-72]，具有肽聚糖DL-內(nèi)肽酶活性的小分子蛋白Ssp1和Ssp2[73]，肽聚糖糖苷鍵水解效應(yīng)因子Tge (Tge1–Tge3) 家族[74]，以及一種細胞壁降解酶家族的新成員TseH[75]等效應(yīng)因子也具有水解細胞壁肽聚糖層的功能。此外，T6SS中一些非效應(yīng)因子也具有肽聚糖水解效應(yīng)。例如，不動桿菌Acinetobacter中的一種肽聚糖水解酶TagX[76]以及霍亂弧菌VgrG家族中的VgrG3蛋白[77-78]能分別在供體菌和受體菌的肽聚糖層產(chǎn)生孔洞以實現(xiàn)T6SS裝置的跨膜組裝和接觸穿刺功能。除了以上水解肽聚糖相關(guān)的效應(yīng)因子外，T6SS還能夠分泌一些脂肪酶、核酸酶、Rhs-重復(fù)蛋白和Non-VgrG蛋白等效應(yīng)因子[79]，這些效應(yīng)因子共同作用發(fā)揮抑菌或損傷宿主細胞的作用。

4.2 基于肽聚糖水解因子調(diào)控的裂解系統(tǒng)的構(gòu)建

本研究團隊的研究方向之一就是構(gòu)建基于T6SS效應(yīng)因子調(diào)控的沙門菌裂解系統(tǒng)。構(gòu)建該系統(tǒng)的關(guān)鍵就在于要將tse1或tse3等編碼肽聚糖水解因子的基因引入到沙門菌基因組中，使其能夠穩(wěn)定遺傳表達。要實現(xiàn)疫苗菌株進入體內(nèi)增殖后裂解而體外培養(yǎng)時不裂解，其難點是在于如何找到一種能嚴謹調(diào)控tse1或tse3基因在體內(nèi)表達而在體外不表達的啟動子。此外，效應(yīng)因子因缺少信號肽序列無法進入細菌自身周質(zhì)空間內(nèi)表達[69]，因此還需在啟動子和tse1或tse3基因之間插入一段信號肽序列去引導(dǎo)效應(yīng)因子進入沙門菌的周質(zhì)空間中表達，例如β-lactamase和PelB等蛋白的信號肽序列[80-81]。本團隊的工作就是構(gòu)建一系列啟動子-信號肽序列-tse1/tse3的組合整合到減毒沙門菌基因組的特定位點，并篩選出具有最佳遺傳屬性和裂解效果的候選疫苗菌株，而這方面的工作還未見相關(guān)報道。

近些年，一些研究學(xué)者在SPI-6 (沙門菌毒力島-6) 編碼的鼠傷寒沙門菌的T6SS中都發(fā)現(xiàn)了具有酰胺酶活性的效應(yīng)因子Tae4及其免疫蛋白Tai4[70-71]。Tae4的晶體結(jié)構(gòu)顯示其屬于細胞壁半胱氨酸肽酶N1pC/P60超家族，與細胞壁的水解和循環(huán)利用有關(guān)[70,82]。一些體外試驗證明了只表達Peri-Tae4蛋白能夠造成大腸埃希菌的顯著裂解死亡[70-71]。T6SS效應(yīng)-免疫系統(tǒng)中的免疫因子一般編碼在與效應(yīng)因子鄰近的下游[63]，因此也可以考慮將鼠傷寒沙門菌染色體中的tai4基因敲除并在tae4基因的上游引入嚴謹?shù)膯幼?周質(zhì)引導(dǎo)信號肽序列的組合，調(diào)控tae4基因能在體外培養(yǎng)時不表達而在體內(nèi)環(huán)境中表達。但是Sana等[83]在體外試驗證明了鼠傷寒沙門菌T6SS的Hcp1蛋白能夠和Tae4相互作用殺死產(chǎn)酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca，這種T6SS的抗菌機制對于鼠傷寒沙門菌在宿主腸道內(nèi)的定植是至關(guān)重要的。因此在構(gòu)建該裂解系統(tǒng)的同時還需考慮是否會對疫苗菌株在腸道內(nèi)的定植能力產(chǎn)生影響。

5 總結(jié)與展望

雖然本文介紹的幾種細菌自動裂解系統(tǒng)在體外試驗或者臨床試驗當(dāng)中取得了不錯的成就，但這些裂解系統(tǒng)都還存在著一定的缺陷。例如阿拉伯糖調(diào)控的延遲裂解系統(tǒng)雖然在臨床體內(nèi)試驗取得了不錯的效果，但是人或動物體內(nèi)也會有痕量的阿拉伯糖存在，可能會導(dǎo)致低劑量的沙門菌長期殘留在體內(nèi)[11-12]；而由金屬離子誘導(dǎo)噬菌體相關(guān)裂解基因表達的裂解系統(tǒng)只是在細胞表面形成孔洞產(chǎn)生菌蛻釋放內(nèi)容物，并不能完全裂解菌體[26,28,30]，而且這種菌蛻載體龐大無法充分刺激機體產(chǎn)生免疫[21,28,30]；而毒素-抗毒素系統(tǒng)大多體現(xiàn)在細菌面對環(huán)境壓力時的程序化死亡[18-19]，雖然Zeta/PzaT毒素能夠抑制細菌細胞壁的合成，但是有相關(guān)報道其可能損害真核細胞[45,47,84]，因此將其用在疫苗上的安全性還有待驗證；而細菌T6SS分泌的肽聚糖水解因子在體外表達時顯示出了不錯的裂解效果[69,71,83]，但還沒有見到應(yīng)用該方法構(gòu)建體內(nèi)自動裂解菌株的報道，其體內(nèi)裂解效果還有待進一步去探索和驗證。除了上文介紹的幾種裂解系統(tǒng)外，還有研究學(xué)者通過表達溶菌酶去構(gòu)建裂解菌株[85]，但溶菌酶成分復(fù)雜可能會對疫苗遞送的保護性抗原產(chǎn)生影響，其遞送抗原的效果還有待進一步驗證。

在構(gòu)建自動裂解菌株的同時，還需要在沙門菌染色體中引入一些其他突變來減弱沙門菌對宿主的毒性以及提高疫苗遞送的效果。例如可以利用調(diào)控延遲減毒技術(shù)去調(diào)控rfaH基因，構(gòu)建的突變株可以在體外合成類似野生型沙門菌的O-抗原，保持侵染定植能力，到體內(nèi)會自動停止O-抗原的合成，減少宿主對沙門O-抗原的免疫反應(yīng)，提高對異源抗原的免疫反應(yīng)[86]；一些小分子刺激物如LPS能誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生caspase-1依賴的細胞凋亡[87]，因此也要適當(dāng)引入一些突變降低LPS的毒性；同時也要引入一些其他突變來保持DNA疫苗在沙門菌疫苗內(nèi)的穩(wěn)定復(fù)制，剔除抗性基因作為篩選標記等。當(dāng)然對于細菌染色體上的突變要適度，過多的突變可能會造成菌株的一些特性發(fā)生改變，反而達不到較好的疫苗免疫效果。將來構(gòu)建成功的自動裂解疫苗載體不僅能夠遞送保護性抗原和DNA疫苗，也有望遞送糖蛋白抗原、多糖抗原甚至抗腫瘤藥物，有著廣泛的應(yīng)用范圍。當(dāng)然基于T6SS相關(guān)效應(yīng)因子構(gòu)建自動裂解菌株是有一定難度，但是憑借本實驗室多年積累的減毒沙門菌疫苗載體構(gòu)建技術(shù)以及和Curtiss實驗室長期的技術(shù)合作關(guān)系，我們是有能力完成這方面工作的。

總之，減毒活疫苗載體是目前疫苗研究的熱點之一，構(gòu)建疫苗載體不僅要考慮應(yīng)如何減弱其毒性，保持其侵襲和定植能力以及誘導(dǎo)免疫的效果，還要考慮如何減弱其對宿主的誘導(dǎo)死亡以及如何清除體內(nèi)殘留的疫苗菌株等問題。自動裂解載體疫苗有著良好的應(yīng)用前景，但還需要進一步去驗證其在臨床上的裂解效果、免疫效果以及對宿主的副作用等。我們相信隨著技術(shù)的不斷進步會逐步解決這些問題，最終能發(fā)展出較為完善的活疫苗載體。