基于二代測(cè)序分析肺癌腦轉(zhuǎn)移與非腦轉(zhuǎn)移分子差異

尤 濤，張廣超，呂曉鵬，劉志剛，王東旭，劉 金

(吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院 放射治療科，吉林 吉林132021)

中國(guó)是肺癌高發(fā)國(guó)家，每年新增患者73.3萬(wàn)，死亡人數(shù)達(dá)到61.0萬(wàn)，肺癌已經(jīng)成為中國(guó)惡性腫瘤中的第一殺手[1]。相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)肺癌進(jìn)行基因?qū)用娴耐蛔儥z測(cè)，已在疾病早篩、靶向治療、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域體現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。循環(huán)腫瘤DNA來(lái)自于凋亡或者壞死的腫瘤細(xì)胞，在很大程度上可以反映腫瘤的分子特征。本研究通過(guò)比較非小細(xì)胞肺癌患者中，發(fā)生腦轉(zhuǎn)移與未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者循環(huán)腫瘤DNA的突變差異，探究非小細(xì)胞肺癌中腦轉(zhuǎn)移的分子突變特征。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至12月在吉林市化工醫(yī)院入院治療的非小細(xì)胞肺癌患者共20例，其中男性6例，女性14例，年齡54-85歲，平均年齡70.85± 8.92 歲。經(jīng)組織病理學(xué)確認(rèn)患者皆為肺腺癌IV期。按照腫瘤有無(wú)轉(zhuǎn)移分為：無(wú)轉(zhuǎn)移12例和腦轉(zhuǎn)移8例。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)合并高血壓病、糖尿病、感染性疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺疾病、長(zhǎng)期使用激素、近期手術(shù)、創(chuàng)傷、嚴(yán)重心肝腎疾病病例；2)1個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗凝或促凝藥物病例。

1.2 二代測(cè)序

血液樣本及DNA提取：使用Streck采血管采集10 ml外周血，輕柔顛倒10次6-35℃保存，備用。 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen) 用于血液DNA提取，Nanodrop 檢測(cè) DNA 的純度(OD 260/280比值)。瓊脂糖凝膠電泳分析 DNA 降解程度以及是否有 RNA、蛋白質(zhì)污染。Qubit 對(duì) DNA 濃度進(jìn)行精確定量。其中 OD 值在1.8-2.0之間，含量在20ng以上的 DNA 樣品被用來(lái)構(gòu)建文庫(kù)。

文庫(kù)構(gòu)建及靶向捕獲：將樣本提取的 DNA隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度為180-220 bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)和加 A 尾后在片段兩端分別連接上接頭制備 DNA文庫(kù)。采用自主研發(fā)的靶向捕獲芯片，經(jīng)過(guò)建庫(kù)和文庫(kù)捕獲進(jìn)行目標(biāo) DNA的高效富集，然后在Illumina NextSeq CN500平臺(tái)上進(jìn)行高通量、高深度測(cè)序。建庫(kù)和捕獲均嚴(yán)格使用說(shuō)明書推薦的試劑和耗材，并參照最新優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行操作。

測(cè)序及生信分析：根據(jù)庫(kù)檢合格文庫(kù)的有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求進(jìn)行 Illumina CN500 平臺(tái)PE150測(cè)序。測(cè)序結(jié)束獲得原始測(cè)序序列(Raw Data)后，進(jìn)行質(zhì)控分析；變異信息通過(guò)BWA工具與人類基因組(hg19)進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)GATK對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行連接優(yōu)化，SNP/Indel通過(guò)VarScan2獲得，分析的結(jié)果通過(guò)千人基因組和dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行過(guò)濾，胚系突變通過(guò)白細(xì)胞分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 樣本體細(xì)胞突變統(tǒng)計(jì)

體細(xì)胞突變是指除生殖細(xì)胞以外的體細(xì)胞所發(fā)生的序列變異，是發(fā)生在正常機(jī)體細(xì)胞中的變異，如發(fā)生在皮膚和器官。體細(xì)胞變異既不遺傳自親本，也不會(huì)傳遞給后代，卻可以引起當(dāng)代某些細(xì)胞的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。體細(xì)胞變異，特別是其中的驅(qū)動(dòng)突變對(duì)解釋腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有非常重要的意義。

本研究中采用的靶向捕獲panel共包含12個(gè)肺癌中常見的突變基因(表1)。突變檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，在20例病人樣本中，共檢測(cè)到4種體細(xì)胞突變，分別為EGFR突變(在9例病人中發(fā)現(xiàn)，突變率45%)、PI3KCA(2例，10%)、KRAS(1例，5%)、NRAS(1例，5%)，共計(jì)10人具有不同程度的基因突變，其余10人未檢測(cè)到突變。

表1 基因檢測(cè)列表

圖1 突變頻率圖

2.2 基因突變頻率

研究進(jìn)一步將發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者與未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行分組比較，在12例未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的病人中，有5人被檢測(cè)出有不同程度的基因突變，占比41.67%，其余7人未發(fā)現(xiàn)突變；在8例發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的病人中，5人(62.5%)被檢測(cè)出有基因突變，其余3人未發(fā)現(xiàn)(表2)。

根據(jù)臨床特征對(duì)高頻突變進(jìn)行分組分析，獲得肺癌腦轉(zhuǎn)移組和肺癌非腦轉(zhuǎn)移組高頻突變圖，肺癌腦轉(zhuǎn)移組相比非腦轉(zhuǎn)移組具有更多的突變基因特征，腦轉(zhuǎn)移組不僅有EGFR、PIK3CA突變，而且還有KRAS、NRAS突變，同時(shí)相比非腦轉(zhuǎn)移組，腦轉(zhuǎn)移組發(fā)生基因突變頻率更高。過(guò)往報(bào)道，EGFR、PIK3CA、KRAS、NRAS均是肺癌驅(qū)動(dòng)基因，因此，相比肺癌非腦轉(zhuǎn)移組，腦轉(zhuǎn)移機(jī)制更復(fù)雜，驅(qū)動(dòng)基因更多。

表2 兩組基因突變率

3 討論

肺癌是一類嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性疾病，是目前全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡病因中致死率最高的疾病，2012年全球肺癌新增病例180萬(wàn)，約占全部癌癥患者的13%[2]。肺癌根據(jù)其分化程度和形態(tài)特征可分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占80%-85%，新診斷非小細(xì)胞肺癌患者中有10%-25%已發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，40%-50%患者治療中發(fā)展為腦轉(zhuǎn)移[3]，腦轉(zhuǎn)移后患者中位總生存期(OS) 僅為3-6個(gè)月[4]，所以能否盡早檢測(cè)到腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生并及時(shí)進(jìn)行治療，對(duì)患者的預(yù)后具有很大的影響。因此，本研究通過(guò)比較非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移患者與未腦轉(zhuǎn)移患者的循環(huán)腫瘤DNA的突變情況，探究非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的分子特征，為非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)及靶向用藥研究提供理論依據(jù)。

研究中靶向捕獲的基因均為肺癌常見突變基因，在20例樣本中，有9例病人被發(fā)現(xiàn)有EGFR基因的突變，突變率為45%，這與以往報(bào)道的亞洲人群肺腺癌Ⅲ-Ⅳ期患者的EGFR突變率51.4%相近[5]，提示結(jié)果的可信度較高，但由于樣本量的限制及樣本的地域局限性，還存在一定偏差。除EGFR突變外，研究中還發(fā)現(xiàn)了PIK3CA、KRAS、NRAS三種突變，突變率分別為10%、5%、5%，雖然突變頻率相對(duì)較低，但是已有過(guò)往的研究證實(shí)，這些基因均為肺癌發(fā)生的驅(qū)動(dòng)基因，它們的突變對(duì)肺癌的發(fā)生往往產(chǎn)生了決定性的影響。

進(jìn)一步比對(duì)發(fā)生腦轉(zhuǎn)移與未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者的體細(xì)胞基因突變情況發(fā)現(xiàn)，腦轉(zhuǎn)移組突變率為62.5%(5/8)，非腦轉(zhuǎn)移組為41.67%(5/12)，相比非腦轉(zhuǎn)移組，腦轉(zhuǎn)移組的突變率升高。此外，腦轉(zhuǎn)移組中不僅發(fā)現(xiàn)了同樣存在于非腦轉(zhuǎn)移組的EGFR與PIK3CA突變，還發(fā)現(xiàn)了未在非腦轉(zhuǎn)移組中檢出的KRAS及NRAS突變，提示肺癌的腦轉(zhuǎn)移相比非腦轉(zhuǎn)組具有更多的基因突變特征及更復(fù)雜的發(fā)生機(jī)制。

綜上所述，肺癌腦轉(zhuǎn)移患者往往更容易發(fā)生體細(xì)胞突變，且突變數(shù)目較非轉(zhuǎn)移患者多，突變頻率更大，利用基于二代測(cè)序的基因靶向捕獲技術(shù)可以檢測(cè)到二者分子層面的差異，描繪二者的基因突變特征，為腦轉(zhuǎn)移的早期篩查甚至靶向用藥提供了重要的指導(dǎo)意義。