外泌體介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

孫榕澤，李佳欣，余楊，王思邈，滕樂生

（吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012）

腫瘤是指在各種致瘤因素的影響下，局部組織中的某種細胞異常增殖所形成的贅生物[1]。目前，手術(shù)治療、化療、放療等常用治療腫瘤的方法存在對患者自身傷害大、易復(fù)發(fā)等問題[2]。腫瘤免疫治療指利用某種方法，使被抑制的免疫系統(tǒng)重新獲取對腫瘤細胞的識別與殺傷能力[3]。目前，腫瘤免疫治療主要分為以下類型：1）使用抗體阻斷免疫系統(tǒng)抑制性受體的免疫檢查點阻斷療法；2）使用自然殺傷細胞（NK）、淋巴因子激活的殺傷細胞、樹突狀免疫細胞、細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞、細胞毒T淋巴細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞、細胞受體嵌合細胞、嵌合抗原受體細胞的過繼細胞療法和癌癥疫苗[4]。在正常情況下，免疫細胞在識別出腫瘤細胞信號后，會以腫瘤抗原呈遞、激活免疫細胞等免疫應(yīng)答方式啟動針對腫瘤細胞的防御機制[5]。腫瘤細胞通過與機體內(nèi)其他細胞之間的物質(zhì)與信息傳遞，構(gòu)建動態(tài)維持腫瘤進展與擴散所需要的特異性信號網(wǎng)絡(luò)，形成復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，進而抑制免疫系統(tǒng)，從而達到免疫逃逸的目的[6]。因此，治療腫瘤的關(guān)鍵在于如何激活被抑制的免疫系統(tǒng)并加強其對腫瘤細胞的防御。

納米制劑遞送藥物被廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫治療。常見的納米藥物載體包括脂質(zhì)體、膠束、聚合物納米凝膠、磁性納米粒和納米膠囊等，它們通常在納米尺度空間內(nèi)生產(chǎn)，以增加其在腫瘤組織中的滲透性和攝取效率。然而，這些納米制劑藥物載體會被機體確定為“非自身”，從而被免疫系統(tǒng)迅速清除。另外，納米制劑遞送藥物通常無法主動感知疾病環(huán)境，不能有效地在腫瘤部位積聚，無法達到準確靶向的效果，對生物內(nèi)源性藥物遞送載體的研究引起廣泛關(guān)注，例如，細胞介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)如中性粒細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞等，以及細胞外微囊泡介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)。

外泌體是一種直徑為30 ~ 150 nm的微囊泡，與微囊、凋亡小體統(tǒng)稱為細胞外微囊泡[7]。外泌體具有典型的磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)以及低免疫原性，可更高效地穿過血腦屏障和胎盤屏障，將來自于源細胞的蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)等生物信息傳遞到受體細胞中，改變其生理病理狀態(tài)或激活下一步信號通路，有作為天然藥物載體的巨大潛力。外泌體作為細胞間信號傳遞的主要載體，在腫瘤細胞與免疫細胞的復(fù)雜通訊網(wǎng)絡(luò)中起至關(guān)重要的作用，一方面幫助免疫細胞之間進行信號交流，從而激活下游效應(yīng)細胞[8]，另一方面將腫瘤細胞特異性抗原呈遞給免疫系統(tǒng)，抑制腫瘤細胞的免疫逃逸[9]。本文重點介紹外泌體介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。

1 外泌體簡介

1.1 外泌體的組成

外泌體由細胞質(zhì)膜向內(nèi)出芽形成，依次形成早期內(nèi)涵體、腔內(nèi)囊泡（ILV）、多囊泡體（MVB），最終通過質(zhì)膜內(nèi)陷釋放到細胞外基質(zhì)中[10]。在此過程中，細胞溶質(zhì)蛋白、核酸和脂質(zhì)等被選擇性地包裹在外泌體中。外泌體包含熱休克蛋白、膜運輸?shù)鞍住⒓毎羌艿鞍?、組織相容性復(fù)合體（MHC）蛋白、表面黏附蛋白等多種非特異性蛋白[11]。在各種對外泌體的研究中，通常通過鑒定多泡小體蛋白（TSG101）、四跨膜蛋白（CD63、CD81、CD8、CD9）和熱激蛋白70（HSP70）等蛋白的表達來證明外泌體是否提取成功。此外，外泌體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)有細胞來源的特異性蛋白，如來自于結(jié)腸上皮細胞分泌外泌體上的A33蛋白[12]和不成熟的樹突狀細胞分泌外泌體中的乳凝集素蛋白[13]，這些蛋白的存在與源細胞的種類和生理狀態(tài)有關(guān)，而其多樣性與細胞來源和細胞生理病理狀態(tài)有關(guān)，例如結(jié)腸上皮來源的A33蛋白和不成熟的樹突狀細胞來源的乳凝集素。外泌體內(nèi)還含有膽固醇、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺等，雖然這些脂質(zhì)的含量相對較低，但它們既可以維持外泌體形態(tài)穩(wěn)定，也可以使外泌體內(nèi)容物免受細胞外酶類的降解[14]。外泌體內(nèi)也含有DNA、mRNA和非編碼RNA等核酸分子[15]，其組成如圖1所示。因此，由于細胞來源和生理病理狀態(tài)的差異，外泌體的組成成分具有高度的異質(zhì)性。外泌體的生物組分也不完全與源細胞相同，外泌體內(nèi)容物的募集被認為是一個有特定分子機制的主動過程。

圖1 外泌體的組成Figure 1 Composition of exosomes

1.2 外泌體功能

外泌體最初被認為是細胞內(nèi)的“垃圾”而被排出，近年來發(fā)現(xiàn)外泌體具有功能活性并可以進行細胞間信息傳遞。Fang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以介導(dǎo)其所攜帶的特異性miRNA在細胞間轉(zhuǎn)移，通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β2（TGF-β2）/SMDA 蛋白家族同源物 2（SMAD2）信號通路影響皮膚纖維化進程。外泌體不僅可以調(diào)控靶細胞的生理過程，還在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。腫瘤細胞產(chǎn)生和分泌的外泌體數(shù)量遠高于非腫瘤細胞，且其生物組分和功能也更為復(fù)雜[17]。腫瘤來源的外泌體能夠參與腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，以及細胞凋亡、血管新生、免疫抗原呈遞、免疫逃逸、腫瘤微環(huán)境重塑等進程[18]。Rong等[19]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞外泌體中TGF-β可以抑制T細胞增殖，誘導(dǎo)輔助T細胞產(chǎn)生免疫耐受，從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。

2 腫瘤免疫治療中的外泌體

2.1 天然的外泌體

2.1.1 免疫細胞分泌的外泌體 來源于免疫細胞的外泌體作為一種重要的媒介，在抑制腫瘤增殖方面的作用不容忽視，不同的免疫細胞之間通過信號交流與物質(zhì)傳遞而誘導(dǎo)產(chǎn)生更強的免疫響應(yīng)，有助于腫瘤的免疫治療。常見的免疫細胞包括B細胞、T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞等[20]；來源于樹突狀細胞的外泌體可以由其他抗原呈遞細胞進一步加工處理[21]。將MHC肽復(fù)合物和細胞間黏附分子1（ICAM-1）呈遞到其他無免疫響應(yīng)的免疫呈遞細胞中，可間接在體內(nèi)增強免疫反應(yīng)[22]。免疫細胞分泌的外泌體可以結(jié)合Toll樣受體配體并激活周圍無響應(yīng)的樹突狀細胞，從而間接在體內(nèi)放大免疫反應(yīng)[23]。另有研究顯示，來自B細胞的外泌體與MHC-Ⅱ結(jié)合后，可以直接刺激CD4+T細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)[24]。

另外，免疫細胞分泌的外泌體可以抑制腫瘤細胞正常生長。Munich等[25]研究證實，樹突狀細胞分泌的外泌體（DC-Exos）可以通過存在其表面的腫瘤壞死因子（TNF）、凋亡相關(guān)因子配體（FasL）及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)蛋白配體（TRAIL）觸發(fā)caspase的活化并誘導(dǎo)癌細胞凋亡。研究表明，樹突狀細胞分泌的外泌體可抑制肺癌小鼠腫瘤的生長[26]。另有研究顯示，來自肺泡巨噬細胞（AMs）的外泌體囊泡（EV）通過轉(zhuǎn)移細胞因子信號3（SOCS3）抑制因子來抑制肺腺癌細胞的增殖和存活[27]。免疫細胞分泌的外泌體與腫瘤微環(huán)境的變化關(guān)系密切，可以直接對腫瘤細胞產(chǎn)生免疫抑制作用，或通過其他免疫細胞間接影響腫瘤免疫通路，從而抑制腫瘤進展。

2.1.2 腫瘤細胞分泌的外泌體 腫瘤細胞分泌的外泌體表面具有特異性抗原或攜帶了源細胞的部分基因與分泌物。這些“特殊”的外泌體可以與免疫細胞進行信息交流和物質(zhì)傳遞，并且能夠刺激免疫細胞改變其生理狀態(tài)與功能，以達到激活下游免疫反應(yīng)、促進抗炎癥因子的分泌及抑制腫瘤細胞增殖等作用。研究顯示，腫瘤來源的外泌體表面所攜帶的HSP70可與NK細胞膜上的膜整合蛋白BCL2與抗凋亡蛋白4（Bag-4）配體相互作用，選擇性激活NK細胞，達到激活下游信號通路的作用[28]。另外，外泌體上表達的BCL2結(jié)合抗凋亡蛋白6（BAG6）會與激活的NK細胞的表面受體NKp30結(jié)合，從而觸發(fā)NK細胞介導(dǎo)的細胞因子釋放和細胞毒性，誘導(dǎo)NK細胞中顆粒酶白細胞介素2（IL-2）、γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的上調(diào)，促進NK細胞對腫瘤細胞的殺傷，達到激活信號通路，增強腫瘤免疫的作用[29]。研究表明，在肺癌中攜帶核小RNA（snRNA）的外泌體可以激活肺上皮細胞中的跨膜蛋白Toll樣受體3，誘導(dǎo)肺中趨化因子的分泌并促進中性粒細胞的募集與極化[30-31]。另有研究顯示，將輻射后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞分泌的外泌體用于疫苗接種可以增加細胞毒性T淋巴細胞對腫瘤組織的浸潤，以達到促進抗腫瘤免疫反應(yīng)的效果[27]。

此外，由于外泌體包載的內(nèi)容物并不單一，造成了其功能的復(fù)雜性，腫瘤來源的外泌體具有相互矛盾的雙重免疫作用，在呈遞腫瘤抗原，刺激免疫細胞的活化，激活免疫反應(yīng)的同時會促進免疫抑制因子的釋放，幫助腫瘤細胞增殖與逃逸[32]。研究顯示，源于黑色素瘤和大腸癌中的外泌體膜表面的HSP72和HSP105能誘導(dǎo)樹突狀細胞分泌大量IL-6，從而激活下游蛋白酶活性，在腫瘤微環(huán)境中降解正常細胞的細胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤侵襲創(chuàng)造有利條件[33]。因此，如何根據(jù)其自身特點正確的利用腫瘤來源的外泌體，發(fā)展其在腫瘤免疫治療中的優(yōu)勢仍需深入研究。

2.2 作為載體的外泌體

外泌體作為一種潛在的理想型藥物遞送載體，可以利用化學(xué)和基因工程等方法對其進行內(nèi)部及膜表面工程化改造，將化學(xué)藥物、功能短肽、小干擾RNA等多種生物活性物質(zhì)包載到外泌體中，可實現(xiàn)特定類型的細胞或組織的靶向藥物遞送。目前，最常用的實現(xiàn)外泌體包載藥物方法有膜融合法、電穿孔法及基因工程法等。

2.2.1 膜融合法 利用外泌體具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)這一特性，可使用共孵育、聚碳酸酯膜擠壓等外源性方法使外泌體與其他類型膜結(jié)構(gòu)或藥物融合[34-35]。與其他方法相比，膜融合法操作簡單，能夠解決外泌體在體內(nèi)極易被降解，半衰期短等問題，提高外泌體的生物利用度，并能夠賦予其靶向性。另外，不同來源的外泌體遞送藥物時會因其自身特性產(chǎn)生不同的抗腫瘤效果。Xu等[36]研究發(fā)現(xiàn)，M1型巨噬細胞分泌的外泌體會提供一個促炎環(huán)境，用共孵育的方法包載紫杉醇（PTX）后會在乳腺癌細胞中通過caspase-3途徑增加PTX抗腫瘤能力。另有研究顯示，利用氨基乙基茴香酰胺-聚乙二醇修飾的巨噬細胞來源的外泌體具有高PTX負載能力，全身給藥后PTX在癌細胞中積累的能力增強，治療效果比直接包載PTX的未修飾外泌體和PTX更好[37]。Li等[38]開發(fā)了一種巨噬細胞衍生的外泌體包被的聚（乳酸-乙醇酸共聚物）納米粒，用于三陰性乳腺癌的靶向化療：首先，利用連續(xù)離心和膜過濾的方法去除外泌體內(nèi)容物，再利用聚碳酸酯膜擠壓的方法將包載藥物的納米粒與外泌體融合，工程化的外泌體包覆納米粒顯著提高了阿霉素（DOX）的細胞攝取效率和抗腫瘤功效，同時明顯延長了DOX的釋放時間。β-欖香烯是一種對多種腫瘤均有療效的天然化合物。研究顯示，包載了β-欖香烯的外泌體可通過下調(diào)P糖蛋白（P-gp）的表達，降低乳腺癌的耐藥性，提高人體對β-欖香烯的敏感度[39]。抗癌藥的大劑量使用通常伴隨著不可避免的全身毒性，而利用膜融合的方法使外泌體包載疏水性或兩親性化療藥物，可降低藥物對正常細胞的毒性，從而提高細胞攝取效率。

2.2.2 電穿孔法 電穿孔也叫電轉(zhuǎn)染，是一種新型外泌體包載核酸藥物的生物技術(shù)[40]。在外加脈沖電場的作用下，外泌體的磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、滲透性增加，形成貫穿膜內(nèi)外親水性的微孔，核酸藥物（如miRNA、siRNA、lncRNA、circRNA等）由于帶有負電荷，在電場作用下可穿過膜上的通道進入，從而實現(xiàn)外泌體對核酸藥物的包載。

在腫瘤免疫治療中，可以通過電穿孔法介導(dǎo)基因藥物的遞送。外泌體具有內(nèi)源性的CD47蛋白，能與巨噬細胞上的信號調(diào)節(jié)蛋白α（SIRP-α）受體相互作用，穩(wěn)定存在于血液中并具有更高效地通過血腦屏障的能力，保護核酸片段的完整性和有效性[41-42]。Kobayashi等[43]通過電穿孔法將合成的miR-199a-3p裝載到外泌體中，該miR-199a-3p-Exo顯著抑制了破骨細胞小鼠模型的腹膜擴散，并降低了腫瘤中肝細胞生長因子受體（c-Met）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）磷酸化和基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）的表達，加速了腫瘤細胞死亡。Wahlgren等[44]采用電穿孔法將絲裂原蛋白激酶（MAPK）-1siRNA包載入外泌體中，進而實現(xiàn)了選擇性沉默淋巴細胞中的MAPK。Khani等[45]將 miRNA（Let-7i、miR-142和miR-155）包載進腫瘤衍生的外泌體，這些外泌體被免疫系統(tǒng)識別后能促進樹突狀細胞成熟和抗原呈遞功能的增強，并且誘導(dǎo)了細胞毒性T細胞的產(chǎn)生。與膜融合方法相比，電穿孔法不僅打破了僅用于包載疏水藥物分子的局限性，還顯著提高了對基因藥物的包載效率[46]。Zhou等[47]研究發(fā)現(xiàn)了一種基于外泌體的雙重遞送生物系統(tǒng)，用于增強胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）的免疫治療以及逆轉(zhuǎn)M2樣腫瘤相關(guān)巨噬細胞（M2-TAM）的腫瘤免疫抑制：該遞送系統(tǒng)由骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSC）外泌體、電穿孔加載的galectin-9 siRNA構(gòu)建，并用奧沙利鉑（OXA）前藥進行表面修飾作為免疫原性細胞死亡（ICD）觸發(fā)器，這種聯(lián)合療法（iEXO-OXA）通過促進腫瘤抑制性巨噬細胞極化、細胞毒性T淋巴細胞募集和Tregs下調(diào)而引發(fā)抗腫瘤免疫。這些研究進一步證實了介導(dǎo)藥物遞送的外泌體可協(xié)同抗癌藥物，激活體內(nèi)先天性與適應(yīng)性免疫反應(yīng)，抑制腫瘤的生長，從而在癌癥治療中發(fā)揮療效。

2.2.3 基因工程法 外泌體的基因修飾是將目的基因轉(zhuǎn)入供體細胞，使外泌體膜上功能配體過表達的一種可行策略。通過基因工程改造供體細胞，使配體或歸位肽與外泌體表面表達的跨膜蛋白融合，隨后被編碼融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的供體細胞會分泌表面帶有靶向配體的外泌體，應(yīng)用于腫瘤的靶向治療[48]。基因工程化的外泌體在多種疾病中均可達到高效靶向治療的效果，是現(xiàn)階段開發(fā)的具有較高生物利用度的給藥載體。Liang等[49]將軟骨細胞親和肽（CAP）與外泌體表面的溶酶體相關(guān)膜糖蛋白2b（Lamp2b）融合構(gòu)建了CAP-Lamp2b質(zhì)粒，獲得了能有效包載miR-140、能特異性進入并將其運送到軟骨細胞的CAP-外泌體，包載miR-140的外泌體能成功歸巢于軟骨細胞中，用于骨關(guān)節(jié)炎治療；與未修飾的外泌體囊泡相比，CAP-外泌體在關(guān)節(jié)內(nèi)注射后僅發(fā)生小范圍的體內(nèi)擴散，從而實現(xiàn)了最大程度地將其保留在關(guān)節(jié)內(nèi)。

表面表達抗原的外泌體也可以用作抗癌疫苗。將編碼外泌體膜基因和抗原基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入供體細胞后，分泌攜帶抗原的外泌體注射后被巨噬細胞內(nèi)化，通過巨噬細胞的免疫功能發(fā)揮作用，增強機體對于抗原的免疫原性，也可作為治療性疫苗抑制腫瘤的生長。Rountree等[50]證實，靶向前列腺癌的前列腺特異性抗原（PSA）和前列腺酸性磷酸酶（PAP）的外泌體疫苗成功抑制了前列腺癌小鼠的腫瘤生長。外泌體疫苗與其他載體介導(dǎo)的癌癥疫苗相比，可提高DNA疫苗的免疫原性，增強疫苗的效價。在黑色素瘤模型中，M1型巨噬細胞分泌的外泌體與脂質(zhì)磷酸鈣（LCP）納米粒包裹的端粒結(jié)合蛋白2（Trp2）疫苗混合后，經(jīng)皮下注射給荷瘤C57BL/6黑色素瘤小鼠，外泌體被巨噬細胞和樹突狀細胞吸收后誘導(dǎo)Th1細胞分泌細胞因子，Trp2疫苗在外泌體輔助下引起強烈的抗原特異性細胞毒性T細胞應(yīng)答，抑制了腫瘤增殖與侵襲[51]。另一項研究采用了轉(zhuǎn)染Ras相關(guān)蛋白RAB27a的A549肺癌細胞的外泌體，BALB/c肺癌裸鼠在注射A549細胞前2周皮下注射了含有RAB27a蛋白的外泌體進行治療，結(jié)果表明，外泌體激活了機體的免疫細胞活化，達到了預(yù)免疫的效果，這可能是由于它們富含有助于誘導(dǎo)免疫激活的分子，抑制了移植瘤的生長[52]。上述這些研究共同強調(diào)了工程外泌體在癌癥環(huán)境免疫調(diào)節(jié)中的重要作用，可用于疾病治療。

基因工程化外泌體針對特定靶基因具有高特異性，可有效改善基因治療中容易脫靶的問題，且將免疫細胞作為供體細胞分泌外泌體時，外泌體本身具有呈遞腫瘤抗原、激活下游信號通路、誘導(dǎo)免疫細胞極化等作用，可協(xié)同包載基因藥物，從而對腫瘤細胞起到殺傷效果，但大部分轉(zhuǎn)染試劑對細胞有一定的毒副作用，未來研究中需要進一步探究其可能存在的問題，以及開發(fā)更有效更安全的導(dǎo)入質(zhì)粒方法。

2.2.4 其他方法 除了上面介紹的3種較為常見的包載方法，還包括一些其他外泌體與藥物的結(jié)合策略。超聲加載方法[53]通過超聲波的機械振動使外泌體膜破裂產(chǎn)生縫隙，使親水性藥物進入囊泡內(nèi)；超聲后，外泌體和藥物的混合溶液在37℃孵育60 min，可以恢復(fù)外泌體膜。研究顯示，超聲介導(dǎo)的外泌體膜微黏度顯著降低，進而降低了外泌體膜的硬度，可獲得比電穿孔法更多的載藥量，提高載藥效率[54]。靜電相互作用指通過靜電相互作用使高價陽離子與外泌體膜表面的負價官能團相連接，增強受體細胞對外泌體的結(jié)合與吸收作用[55]。然而，有些陽離子材料可能具有細胞毒性，且陽離子材料隨著外泌體進入細胞后會導(dǎo)致溶酶體降解，降低外泌體的裝載效率[56]。另有研究顯示，可以通過使用藍光將細胞內(nèi)蛋白主動裝載到外泌體中，即利用光學(xué)可逆的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來裝載蛋白質(zhì)[57]。這種方法無需蛋白純化步驟，可提高治療性蛋白的裝載和遞送效率。

3 外泌體載藥系統(tǒng)在腫瘤免疫治療中的問題

3.1 影響外泌體包載效率的因素

3.1.1 外泌體的分離與純化 目前，準確和標準的外泌體純化方法較少，使用不同方法獲得的外泌體其收率與純度差別較大，因此有關(guān)外泌體的質(zhì)量標準無法統(tǒng)一評價。通常研究人員會根據(jù)研究目的不同選擇適當?shù)姆蛛x方法：外泌體作為載體介導(dǎo)藥物遞送系統(tǒng)時，由于其膜上的蛋白質(zhì)等物質(zhì)可能起到靶向的作用，所以對外泌體膜結(jié)構(gòu)的完整性有較高的要求。超速離心法是外泌體純化最常用的手段，低速離心和高速離心交替進行的方法通常用于從大量樣品中分離外泌體，但獲得的外泌體純度不高[58]。當外泌體用于癌癥疫苗進行免疫治療時，需要獲取大量的外泌體，因此，必須選擇產(chǎn)量高的分離方法。超濾通過截留不同相對分子質(zhì)量的物質(zhì)可以選擇性地分離外泌體，相對節(jié)省時間和花費，但分離的外泌體數(shù)量有限、純度低[59]。其他提取方法還包括磁珠免疫法[60]和多聚物沉淀法[61]。這2種方法操作簡單，收率高，但普遍存在雜質(zhì)污染問題，污染源主要包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)聚集體和其他脂溶性顆粒。研究顯示，外泌體對siRNA等基因藥物的包載效率約25%[62]。外泌體的收率過低與低純度會影響其對藥物包載效率，難以實現(xiàn)大批量生產(chǎn)，未來需要研究出速度快、成本低且可以從較大的樣本中提取外泌體的方法，為實驗研究及臨床應(yīng)用提供充足的用藥保障。

3.1.2 包載方法 外泌體包載藥物的方法中比較被認可的有膜融合、電穿孔法和基因工程法等。應(yīng)該根據(jù)包載藥物的分子極性、相對分子質(zhì)量及自身所帶電荷等性質(zhì)選擇不同的包載方法。不同包載方法對于同一種藥物的包載效率可能完全不同。Hettich等[63]研究表明，對于親水性小分子化合物熒光黃染料的包載中，滲透壓法和凍融法的包載效率最高，其次是膜融合法。當外泌體與含有可溶性物質(zhì)的脂質(zhì)體進行膜融合后，會改變自身形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理狀態(tài)，使得靶細胞對外泌體的攝取數(shù)量增加，藥物遞送效率提高[64-65]。Yang等[66]成功開發(fā)了一種細胞納米穿孔技術(shù)（cellular nanoporation，CNP），該技術(shù)是將單層培養(yǎng)的細胞置于直徑500 nm納米孔道的芯片上，將整個裝置孵育在目標質(zhì)粒DNA的緩沖液中，然后通過定向電流使細胞膜受到損傷，從而使帶負電的核酸質(zhì)粒順著電勢差從納米孔道中進入細胞內(nèi)。與電穿孔法相比，納米電穿孔對細胞的損傷集中在孔道附近，對細胞膜整體影響小，該方法可以在短時間內(nèi)近乎無損地將質(zhì)粒導(dǎo)入細胞，同時增加內(nèi)源性mRNA在外泌體中的轉(zhuǎn)錄；與傳統(tǒng)的電穿孔法相比，CNP產(chǎn)生的外泌體數(shù)量多出50倍以上，外泌體中mRNA轉(zhuǎn)錄效率增加了1 000倍。目前，沒有一種方法能夠完全適用于不同藥物的包載。研究顯示，與轉(zhuǎn)染方法相比，電穿孔法對于很多藥物具有更高的包載效率，但用電穿孔法進行基因藥物如siRNA的包載時，會誘導(dǎo)吸附作用，產(chǎn)生核酸沉淀，導(dǎo)致包載效率降低[67]。后續(xù)研究將進行包載效率的驗證以及包載方法的優(yōu)化，以最小的載體與藥物的比例將藥物有效地裝載到外泌體中，以達到所需的劑量和釋放曲線。

3.2 影響外泌體藥物遞送的因素

3.2.1 靶向性 未做膜修飾的工程化外泌體作為藥物遞送載體，具有天然歸巢能力，但外泌體的來源與組成成分決定了其優(yōu)先靶向的細胞與組織。例如，含淀粉樣蛋白β（A4）蛋白的外泌體優(yōu)先靶向神經(jīng)元[68]；而表達四跨膜蛋白8（Tspan8）復(fù)合物的外泌體最容易被內(nèi)皮細胞和胰腺細胞吸收[69]。然而，由于其他組織非特異性攝取外泌體而導(dǎo)致的內(nèi)在脫靶效應(yīng)仍然是臨床應(yīng)用的一大障礙[70]，如何使外泌體在參與體內(nèi)復(fù)雜的代謝反應(yīng)后仍能夠準確遞送藥物是后續(xù)研究的重點。

3.2.2 穩(wěn)定性 體液中的穩(wěn)定性是影響運載工具功效的另一個關(guān)鍵因素。外泌體因其內(nèi)源性生物發(fā)生機制，顯示出高度的生物相容性與低免疫原性，使其在與宿主細胞的融合中可以避開內(nèi)溶酶體途徑，決定了它們在體內(nèi)具有高度穩(wěn)定性，顯示出更加高效的藥物運輸能力。然而，研究顯示，外泌體在體內(nèi)的代謝周期較短[71]，而且選擇緩沖液種類的不同，包載基因藥物的外泌體穩(wěn)定性也有所不同，如RNA有可能從外泌體中釋放或在電穿孔后降解[72-75]，所以外泌體介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)在運輸過程中其包載的藥物發(fā)生損失或降解的動態(tài)過程無法確定。

4 結(jié)語與展望

外泌體為一種新型藥物遞送載體，具有低免疫原性、天然靶向性等優(yōu)點，在腫瘤免疫治療方面具有較好的效果。由于外泌體可以在血液、尿液、唾液和腦脊液中檢測到，因此，它們可以作為一種理想的用于癌癥診斷的生物標志物；另外，外泌體中包含的蛋白、核酸分子等物質(zhì)也可作為診斷腫瘤發(fā)生與否的標志分子。然而，如何將外泌體從實驗室引入臨床應(yīng)用中，還存在巨大的挑戰(zhàn)：1）產(chǎn)量問題是有待解決的問題之一[75]?，F(xiàn)有的分離技術(shù)收集的外泌體產(chǎn)量無法達到投入臨床使用的標準，如大規(guī)模生產(chǎn)需要投入的成本也難以估算。2）已經(jīng)包載藥物的外泌體如何運輸和儲藏也是亟需研究和解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)，保存外泌體樣本的最佳溫度是-80℃[76]；另一種途徑是在室溫下采用凍干粉保存[77]。3）儲存引起外泌體生物活性變化的機制仍不清楚。對這種機制的進一步研究可能有助于合理設(shè)計改進策略，以防止外泌體在儲存中喪失功能，這將顯著拓寬外泌體的潛在治療應(yīng)用。因此，如何儲存對外泌體功能的實現(xiàn)至關(guān)重要，另外修飾或載藥的外泌體穩(wěn)定性和毒性也需要進一步探索，特別是作為癌癥納米藥物的載體，不同來源的外泌體可能會參與不同細胞間相互作用，引發(fā)體內(nèi)復(fù)雜的生理反應(yīng)。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在不遠的將來對外泌體作為遞藥系統(tǒng)在腫瘤免疫治療中的作用的研究將更加完善。