腫瘤免疫治療中新生抗原預(yù)測與篩選技術(shù)研究進(jìn)展

顧芳玲，姚文兵，田浤

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211198）

腫瘤新生抗原是由體細(xì)胞突變產(chǎn)生的能被特異性T細(xì)胞識別的多肽，是一種腫瘤特異性抗原。由于腫瘤新生抗原不在胸腺中表達(dá)，不受中樞耐受性的影響，與非突變的腫瘤相關(guān)抗原相比具有更強(qiáng)的免疫原性[1]；同時，正常組織細(xì)胞不表達(dá)腫瘤新生抗原，故靶向腫瘤新生抗原的免疫治療不會引起對非腫瘤組織的脫靶損傷，具有更好的安全性[2]。因此，從免疫學(xué)角度而言，腫瘤新生抗原是腫瘤免疫治療的理想靶點。靶向腫瘤新生抗原的疫苗、T細(xì)胞受體嵌合T細(xì)胞療法和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞療法均已進(jìn)入了臨床研究階段。準(zhǔn)確快速地鑒定腫瘤新生抗原對于成功的免疫治療至關(guān)重要，也是目前個性化免疫治療中的一個難點。本文對腫瘤新生抗原的各種來源、基于高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行腫瘤新生抗原預(yù)測的算法以及腫瘤新生抗原篩選和鑒定方法進(jìn)行綜述，以期為靶向腫瘤新生抗原的免疫治療提供參考。

1 腫瘤新生抗原的來源

1988年，de Plaen等[3]研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，來自小鼠P815腫瘤細(xì)胞經(jīng)誘變處理產(chǎn)生的突變肽可被T細(xì)胞識別。隨后一系列研究證明，腫瘤體細(xì)胞突變也能產(chǎn)生可被T細(xì)胞識別的突變肽，證實了腫瘤新生抗原的存在[4-6]。自2012年始，高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用，進(jìn)一步證明了腫瘤突變可以從各種來源獲得，且來源于這些突變的新生抗原已被證明能夠引起 CD8+T或CD4+T淋巴細(xì)胞的有效應(yīng)答[7-9]。

根據(jù)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）的限制性，可以將腫瘤新生抗原分為MHCⅠ類和MHCⅡ類2種。經(jīng)MHCⅠ類分子提呈的表位被稱為CD8+T細(xì)胞表位?？乖岢始?xì)胞表面的MHC-肽復(fù)合物與T細(xì)胞表面受體結(jié)合從而激活了T細(xì)胞。被激活的細(xì)胞毒性T細(xì)胞可以在體內(nèi)直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是最受研究者關(guān)注的腫瘤新生抗原類型。然而，深入研究發(fā)現(xiàn)，單一的MHCⅠ類表位難以產(chǎn)生持續(xù)的抗腫瘤作用，越來越多的證據(jù)表明CD4+T細(xì)胞表位（即MHCⅡ類表位）在抗腫瘤方面也起到積極的作用[10-12]。有研究人員在3種不同的小鼠腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)具備免疫原性的腫瘤新生抗原是由CD4+T細(xì)胞識別的[13]。

腫瘤新生抗原的來源可以分為5類：1）基因組變異，包括單核苷酸變異（single-nucleotide variations，SNVs）和插入/缺失突變（insertions and deletions，Indels）；2）基因融合；3）轉(zhuǎn)錄組選擇性剪接；4）RNA 編輯；5）轉(zhuǎn)錄組非編碼區(qū)突變。

1.1 單核苷酸變異和插入/缺失突變

SNVs是腫瘤中最常見的基因組水平突變類型，非同義突變編碼蛋白產(chǎn)生的變異肽可能通過 MHC分子呈遞到腫瘤細(xì)胞表面，形成腫瘤新生抗原。近來研究表明，基于SNVs的新生抗原負(fù)荷與經(jīng)免疫檢查點抑制劑治療患者的臨床獲益具有相關(guān)性。Charoentong等[14]基于腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）對20種實體腫瘤的免疫微環(huán)境景觀和腫瘤新生抗原進(jìn)行了研究，并創(chuàng)建了腫瘤免疫組圖譜。

處于外顯子區(qū)域的Indels突變會引起移碼，從而形成一個新的開放閱讀框，并可能產(chǎn)生大量與自身高度不同的新生抗原。盡管Indels的發(fā)生頻率比SNVs低，但對來自TCGA的19種癌癥類型的5 777個實體瘤的大規(guī)模分析顯示，Indels產(chǎn)生的新生抗原比SNVs衍生的新生抗原更具免疫原性[8]。同樣，研究發(fā)現(xiàn)，基于Indels的新生抗原負(fù)荷也與黑素瘤患者對免疫檢查點抑制劑治療應(yīng)答存在顯著相關(guān)性[8]。

1.2 基因融合

結(jié)構(gòu)變異是大多數(shù)腫瘤基因組的標(biāo)志，包括倒位、缺失、重復(fù)和易位。其中易位導(dǎo)致的基因融合會改變閱讀框架，從而形成腫瘤新生抗原。Yang等[9]研究證明了基因融合是免疫原性腫瘤新生抗原的重要來源，并報道了DEK-AFF2和NFIB-MYB的基因融合，可以被MHCⅠ類復(fù)合物呈遞，從而引起有效的CD8+T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。類似的，最近研究人員證實，CBFB-MYH11融合基因產(chǎn)生的新生抗原能夠被遞呈于腫瘤細(xì)胞表面，并激活T細(xì)胞識別和殺死腫瘤細(xì)胞，可見靶向性新生抗原的治療在低突變頻率的癌癥中也具有臨床意義[15]。

1.3 轉(zhuǎn)錄組選擇性剪切

選擇性剪接是細(xì)胞中維持所產(chǎn)生蛋白多樣性的一種常見機(jī)制。通過選擇性剪接，基因的特定外顯子可能被排除在成熟的mRNA之外或保留特定內(nèi)含子，導(dǎo)致基因組編碼的蛋白質(zhì)多樣性增加。剪接因子（如U2AF1和SF3B1）發(fā)生突變可能導(dǎo)致腫瘤中剪接事件的廣泛改變。Kahles等[16]對TCGA數(shù)據(jù)庫中8 705例患者的泛癌分析表明，選擇性剪接也是腫瘤新生抗原的重要來源。Smart等[17]研究證實，保留內(nèi)含子也是腫瘤新生抗原的來源之一。

1.4 RNA編輯

RNA編輯是一種常見的轉(zhuǎn)錄后修飾，可以改變RNA序列中的特定核苷酸，也可以導(dǎo)致非同義替換，從而產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)。A ~Ⅰ的RNA 編輯是人類最常見的RNA編輯類型，它會提高包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的蛋白質(zhì)組的多樣性[18]。由A ~Ⅰ的RNA編輯產(chǎn)生的多肽由MHCⅠ類分子自然呈遞并引發(fā)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，表明RNA編輯擴(kuò)展了人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）呈遞的自身抗原類別，并且這些抗原可被免疫系統(tǒng)識別[19]。

1.5 轉(zhuǎn)錄組非編碼區(qū)突變

99%的癌癥突變發(fā)生在非編碼區(qū)域，而外顯子組僅占人類基因組的2%；然而，高達(dá)75%的基因組可以被轉(zhuǎn)錄并潛在地翻譯成蛋白質(zhì)。最近的研究表明，許多所謂的非編碼區(qū)實際上也具有編碼蛋白質(zhì)的能力，可以產(chǎn)生許多由MHCⅠ類分子遞呈的肽。Laumont等[20]用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和RNA測序?qū)Π籽『头伟┗颊叩姆蔷幋a序列進(jìn)行了研究，在非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了大量的突變和未突變的抗原，其中一些已被確定為腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的靶標(biāo)。值得注意的是，來源于非編碼區(qū)的MHCⅡ類分子限制性新生抗原尚未有文獻(xiàn)報道。

2 腫瘤新生抗原的預(yù)測

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，研究人員可以分析腫瘤的基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并借助計算機(jī)預(yù)測潛在的腫瘤新生抗原，這是個性化免疫治療中極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。腫瘤新生抗原預(yù)測的流程如圖1所示，這一流程中的每一步驟均涉及到生物信息學(xué)工具的使用和需要權(quán)衡的因素。

圖1 腫瘤新生抗原預(yù)測流程示意圖Figure 1 Schematic diagram of tumor neoantigen prediction

2.1 突變序列的識別與篩選

新生抗原的預(yù)測需要獲得腫瘤細(xì)胞與非腫瘤組織的基因組和轉(zhuǎn)錄組信息?？捎糜跍y序的樣本類型包括新鮮冷凍的組織、cDNA、血液等。高異質(zhì)性的瘤內(nèi)組織需要收集多個活檢部位進(jìn)行測序[21]。全外顯子測序因其高效性、高覆蓋的優(yōu)勢，是用于預(yù)測腫瘤新生抗原的標(biāo)準(zhǔn)測序方法，但也可以使用RNA測序方法。RNA測序包括了整個轉(zhuǎn)錄組RNA測序，因此可以用于分析RNA編輯、轉(zhuǎn)錄后修飾等產(chǎn)生的突變肽[22]。

已有研究證明， SNVs和Indels衍生的突變蛋白可以同時被 MHCⅠ類和MHCⅡ類分子呈遞，并引起足夠的 CD8+T和 CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。這2種類型的基因組變體是基因組水平上腫瘤新生抗原的主要來源，目前針對這2種變異已開發(fā)了大量的分析算法。

進(jìn)行SNVs分析需要解決3個問題：低頻突變的檢測、區(qū)分種系變異和消除測序偽跡。MuTect2和Strelka在檢測低等位基因分?jǐn)?shù)的SNV時具有很高的靈敏度，從而可進(jìn)行精確的亞克隆變異檢測。VarScan2和SomaticSniper需要更高的等位基因分?jǐn)?shù)來識別變異體，但在區(qū)分種系變異和腫瘤變異中可以提高性能。同時運行多種算法可以提高檢測精度，例如，Callari等[23]通過將來自多個比對管線的結(jié)果取交集，然后合并來自MuTect2和Strelka的相交結(jié)果，在不增加假陽性率的情況下使檢測靈敏度提高了17.1%。

2.2 HLA分型的計算與分析

由于HLA基因廣泛的個體化，準(zhǔn)確的HLA單倍分型對于準(zhǔn)確預(yù)測新生抗原至關(guān)重要。該過程的金標(biāo)準(zhǔn)是利用序列特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增進(jìn)行臨床HLA分型。然而，臨床分型可能費時、費力且價格昂貴，所以一個常見的替代方法是使用病人的測序數(shù)據(jù)集計算 HLA 分型。

與臨床分型結(jié)果相比，Ⅰ類HLA分型算法的預(yù)測準(zhǔn)確率可達(dá)99%[24-25]。其中，OptiType、Polysolver和PHLAT工具目前報告的準(zhǔn)確率最高。與Ⅰ類HLA 分型算法相比，Ⅱ類HLA分型算法仍需進(jìn)一步開發(fā)以提高其預(yù)測精度。最近，Orenbuch等[26]發(fā)布了arcasHLA工具，其對Ⅰ類基因的雙字段分辨準(zhǔn)確率為100%，對Ⅱ類基因的準(zhǔn)確率超過99.7%。

除了對HLA分型進(jìn)行計算之外，HLA變異也是腫瘤新生抗原預(yù)測中值得關(guān)注的問題。HLA基因拷貝數(shù)變異導(dǎo)致的雜合性缺失會致使腫瘤免疫逃逸[27]。針對腫瘤中HLA突變的分析顯示，HLA突變可能會導(dǎo)致功能喪失，從而影響抗原的遞呈[28]?？乖f呈相關(guān)的其他蛋白組分出現(xiàn)突變也會影響抗原遞呈。在肺癌和結(jié)腸癌中，B2M的突變或雙等位基因丟失會導(dǎo)致缺乏Ⅰ類HLA[29-30]。因此，在腫瘤新生抗原的預(yù)測和篩選中，需要優(yōu)先考慮能結(jié)合未突變HLA基因的新生抗原。

2.3 突變肽與MHC分子親和力的預(yù)測

通常MHC分子與肽的結(jié)合被認(rèn)為是抗原呈遞過程中最具選擇性的步驟。目前MHCⅠ類分子與肽的親和力預(yù)測已能達(dá)到較高的精度，大多數(shù)等位基因的典型曲線下面積分?jǐn)?shù)大于 0.90。這些預(yù)測算法已成為傳染病、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫、腫瘤免疫和疫苗開發(fā)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)工具。

2.3.1 突變肽與MHCⅠ類分子的親和力預(yù)測 NetMHC 4.0是基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的算法所開發(fā)，NetMHCpan 4.0在其訓(xùn)練集中包括了質(zhì)譜鑒定的MHC配體[31]。NetMHCpan 4.0模型提供2個輸出，一個是預(yù)測的肽/MHC結(jié)合的親和力，另一個是在質(zhì)譜-HLA配體洗脫實驗中鑒定的可能性，其4.1版本在獨立軟件包的基礎(chǔ)上提供了簡易的網(wǎng)頁模式。MHCflurry是采用類似的機(jī)器學(xué)習(xí)算法建立的開源預(yù)測工具[32]。Boehm等[33]用質(zhì)譜鑒定的肽配體作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)，建立了基于隨機(jī)森林算法MHCⅠ類配基預(yù)測算法。盡管這些工具并未顯示出明顯優(yōu)于NetMHCpan 4.0的準(zhǔn)確性，但它們的優(yōu)點是開源，更容易集成到生物信息處理的管道中。

一些研究已表明，肽/MHC 復(fù)合物的半衰期比肽與MHC 親和力更能預(yù)測其免疫原性[34]。雖然有netMHCstab 等工具可以用于預(yù)測pMHC穩(wěn)定性，但因為親和力預(yù)測工具具有更大的訓(xùn)練集的優(yōu)勢，大多數(shù)研究者還是采用了親和力算法。然而，最近報道的肽/MHC穩(wěn)定性的高通量分析方法可能為通過肽/MHC 復(fù)合物穩(wěn)定性預(yù)測腫瘤新生抗原創(chuàng)造了機(jī)會[35]。

2.3.2 突變肽與MHCⅡ類分子的親和力預(yù)測 盡管已有研究表明，Ⅱ類限制性新生抗原反應(yīng)對某些抗腫瘤反應(yīng)是至關(guān)重要的，但目前大多數(shù)預(yù)測新生抗原的管道并不根據(jù)MHCⅡ類分子的親和力預(yù)測結(jié)果來篩選腫瘤新生抗原。一方面是由于缺乏訓(xùn)練數(shù)據(jù)，IEDB數(shù)據(jù)庫中MHCⅡ類配體的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于MHCⅠ類配體；另一方面，由于MHCⅡ的肽結(jié)合槽在兩端是開放的，允許長度可變的長肽結(jié)合，導(dǎo)致對MHCⅡ類配體建模更加困難。

最常用的MHCⅡ配體預(yù)測器是NetMHC套件中的NetMHCIIpan[36]。NetMHCIIpan使用與 NetMHCpan相似的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但在訓(xùn)練過程中使用迭代方法預(yù)測訓(xùn)練期間每個肽的結(jié)合核心。使用NetMHCIIpan 的分析與使用 NetMHCpan的分析非常相似，結(jié)果報告為每個肽和等位基因的親和力值。NetMHCIIpan 4.0的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集已經(jīng)覆蓋了116 個不同的 MHCⅡ類分子。MixMHC2pred工具使用多等位基因質(zhì)譜數(shù)據(jù)集訓(xùn)練Ⅱ類預(yù)測因子，通過基序聚類分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后根據(jù)具有共同等位基因的個體之間的共享聚類模式將聚類與等位基因相關(guān)聯(lián)[37]。NetMHC 套件的開發(fā)人員也采用了這種方法，將單等位基因和多等位基因的質(zhì)譜訓(xùn)練數(shù)據(jù)混合在一起，并使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行基序識別[38]。

2.3.3 突變肽的加工預(yù)測 目前，腫瘤新生抗原的研究重點大部分集中在預(yù)測病人的MHC分子和特定突變肽的親和力上。然而，即使一個肽具有很強(qiáng)的MHC 結(jié)合能力，如果上游處理阻止了該肽的實際負(fù)載，那么這個預(yù)測可能是毫無意義的。肽的加工，特別是免疫蛋白酶體加工和肽裂解，是新生抗原預(yù)測中必須考慮的因素。

對于MHCⅠ類和 MHCⅡ類抗原遞呈途徑來說，在肽和MHC分子相互作用之前的一個重要步驟是蛋白質(zhì)通過免疫蛋白酶體降解成肽。現(xiàn)在可以利用NetChop20S、NetChopCterm、ProteaSMM等工具來獲得蛋白酶體的特異性，并預(yù)測不同蛋白酶靶向的蛋白裂解位點[39]。在該領(lǐng)域發(fā)展起來的算法通常是根據(jù)體外蛋白酶體消化數(shù)據(jù)或體內(nèi)MHCⅠ和MHCⅡ配體洗脫數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練?；谏窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測方法 NetChop-3.1 Cterm 已被證明在預(yù)測體內(nèi)蛋白質(zhì)水解方面有較好的表現(xiàn)[40]。

2.4 候選抗原肽的優(yōu)先級排序

對于最終候選抗原肽的選擇，目前并沒有非常公認(rèn)的選擇標(biāo)準(zhǔn)。候選抗原肽的選擇需要綜合考慮以下幾點因素：首先，突變序列能否在腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、被翻譯成蛋白質(zhì)且成功被轉(zhuǎn)運加工進(jìn)而呈遞；其次，應(yīng)該考慮突變肽與相應(yīng)MHC分子的結(jié)合能力和穩(wěn)定性，MHC分子自身的表達(dá)與突變情況，還需要考慮不同突變肽對MHC分子結(jié)合的競爭；最后，T細(xì)胞受體庫是否足夠多樣、肽/MHC復(fù)合體和T細(xì)胞受體之間的結(jié)合能力也應(yīng)該被納入考量[41]。

2.5 集成的預(yù)測管道

由于在腫瘤新生抗原的生成、加工、結(jié)合和識別過程中涉及到許多因素，研究人員開發(fā)了許多生物信息學(xué)管道以匯集現(xiàn)有的工具，為不同的臨床目的簡化新生抗原識別過程。例如：預(yù)測對免疫檢查點阻斷療法的反應(yīng)、設(shè)計基于肽或載體的疫苗等。表1列出了一些常用的預(yù)測管道，這些管道將為腫瘤新生抗原預(yù)測提供一個全面的關(guān)鍵信息匯總。

表1 腫瘤新生抗原預(yù)測常用管道Table 1 Tumor neoantigen prediction and prioritization pipelines

pVACtools 是一套集成的計算框架，可以為腫瘤新生抗原的預(yù)測提供端到端的解決方案[42]。pVACtools支持識別不同來源的突變肽，包括：點突變、移碼插入和缺失以及基因融合。預(yù)測肽和MHC分子的結(jié)合是通過支持 MHCⅠ類和 MHCⅠ類結(jié)合算法集合在一個框架內(nèi)完成的。通過整合不同的數(shù)據(jù)，包括突變等位基因的表達(dá)，肽結(jié)合的親和力，以及確定一個突變是克隆還是亞克隆，可以對預(yù)測的多肽進(jìn)行優(yōu)先排序。這個工具還包括了一些支持新生抗原疫苗設(shè)計的模塊。

MuPeXI 工作流程與pVACtools中的pVACseq模塊相似[43]。MuPeXI 需要用戶輸入包含體細(xì)胞突變調(diào)用的文件、 HLA 類型列表和可選的基因表達(dá)譜。MuPeXI 輸出結(jié)果是一個表格，其中列出了所有來自SNVs和Indels的腫瘤特異性突變肽以及全面的注釋，包括HLA結(jié)合和與正常肽的相似性，這些肽將按照一個優(yōu)先分值進(jìn)行分類，以便粗略地預(yù)測免疫原性。MuPeXI工具的一個優(yōu)勢是其使用 NetMHCpan 4.0進(jìn)行MHCⅠ類結(jié)合預(yù)測，使用戶能夠從結(jié)合親和力和洗脫配體數(shù)據(jù)訓(xùn)練的預(yù)測器中受益。MuPeXI可以作為獨立軟件或網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器使用。

TIminer集成了一組生物信息學(xué)工具來分析單一樣本的 RNA-seq 數(shù)據(jù)和體細(xì)胞 DNA 突變，包括：1）從高通量測序數(shù)據(jù)中分析 HLA 分型；2）利用突變數(shù)據(jù)和 HLA 類型預(yù)測腫瘤新生抗原；3）從轉(zhuǎn)率組測序數(shù)據(jù)中分析鑒定腫瘤浸潤免疫細(xì)胞；4）從表達(dá)數(shù)據(jù)中定量分析腫瘤免疫概況。TIminer的一個優(yōu)勢是能夠處理原始 RNA測序數(shù)據(jù)并提取與新生抗原預(yù)測的信息[44]。

OpenVax新生抗原預(yù)測管道是從早期的Epidisco工作流程演變而來，后者更關(guān)注計算機(jī)集群并行性。OpenVax是流水線式的自動化讀取處理和體細(xì)胞變體調(diào)用，支持SNVs和Indels突變體。OpenVax也是一個端到端的工作流程，從原始DNA和RNA FASTQ數(shù)據(jù)開始，生成包含突變的肽，將其列為疫苗包含的最終輸出。目前，使用OpenVax必須向軟件提供 HLA 類型。OpenVax管道是可配置的，允許用戶指定使用哪個 MHCⅠ類結(jié)合預(yù)測器，以及 MHC結(jié)合親和力和變異基因特異性表達(dá)的閾值。OpenVax管道的最終結(jié)果是一組按用戶指定長度排列的合成長肽（synthetic long peptides，SLPs），優(yōu)化后用于SLP疫苗。值得關(guān)注的是，目前有3個用于腫瘤新生抗原疫苗的Ⅰ期臨床實驗（NCT02721043、T03223103和 NCT03359239）使用的長肽疫苗是基于該OpenVax管道設(shè)計的[44]。

NeoFuse是一種從腫瘤RNA-seq數(shù)據(jù)中預(yù)測融合新生抗原的計算管道，可識別可能作為免疫治療合適靶點的融合新生抗原[49]。NeoFuse主要包括五大模塊，分別為HLA分型檢測、預(yù)測融合肽、肽與MHC結(jié)合親和力、基因表達(dá)水平量化和對候選融合肽排序。NeoFuse管道可以在隔離環(huán)境中運行，防止與托管環(huán)境中的其他程序發(fā)生沖突。

3 腫瘤新生抗原的篩選與驗證

各種針對腫瘤新生抗原的免疫治療策略的最終目的是引發(fā)和（或）擴(kuò)大腫瘤特異性T細(xì)胞應(yīng)答。由于疫苗的制造周期和患者病情發(fā)展的限制，很多針對腫瘤新生抗原的臨床研究很難具備充分的時間對預(yù)測得到的候選腫瘤新生抗原進(jìn)行免疫學(xué)性質(zhì)的驗證。然而，在一項關(guān)于患者對預(yù)測的腫瘤新表位疫苗接種反應(yīng)的報告中，3名黑色素瘤患者分別接種了與MHC親和力預(yù)測結(jié)果為IC50小于500 nmol · L-1的肽；在測試的21種肽中，只有9種誘導(dǎo)了T細(xì)胞應(yīng)答[51]。此外，新近研究報道中，研究人員從B16F10黑色素瘤細(xì)胞株中鑒定出一個“抑制性”腫瘤新生抗原表位，該表位可促進(jìn)荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤生長[52]。由此可見，腫瘤新生抗原表位的驗證需要進(jìn)行更多的研究。

3.1 常規(guī)免疫分析方法

基于已被激活的T細(xì)胞接受相同抗原再刺激時可以釋放大量的干擾素-γ（IFN-γ）的作用機(jī)制，IFN-γ ELISPOT是目前最為常用的驗證各種抗原肽免疫原性的分析方法。該方法普遍用于驗證患者經(jīng)過免疫治療，對各種預(yù)測的腫瘤新生抗原的應(yīng)答情況[53-54]。MHC多聚體技術(shù)靈敏度較高，是檢測抗原特異性T細(xì)胞的常規(guī)方法，能檢測到所含比例低于0.1%的新生抗原特異性T細(xì)胞。該技術(shù)被廣泛用于檢測特定新生抗原特異性T細(xì)胞，以評價免疫治療效果。該技術(shù)也可用于篩選具有免疫原性的新生抗原[55-56]。

3.2 基于TCR譜的分析方法

腫瘤特異性T細(xì)胞應(yīng)答也可通過表征患者在免疫治療前后T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）庫的變化來進(jìn)行分析。目前關(guān)于TCR譜的研究主要集中在代表獨特T細(xì)胞克隆的CDR3序列的鑒定和表征上，這一過程稱為TCR克隆分型，已被用于鑒定個體化癌癥疫苗接種后或檢查點封鎖治療后對新生抗原的克隆性T細(xì)胞應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，患者TCR庫的大小和多樣性與患者對免疫療法的反應(yīng)之間存在相關(guān)性[57]。從外周血或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中觀察到的 TCR 譜系的克隆性和多樣性的變化表明正在發(fā)生抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答。Lu 等[58]最近開發(fā)了一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法，通過用串聯(lián)小基因轉(zhuǎn)染或肽脈沖自體抗原遞呈細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞來鑒定新生抗原特異性TCRs，然后利用單個新生抗原的實驗驗證數(shù)據(jù)來訓(xùn)練和改進(jìn)當(dāng)前的新生抗原優(yōu)先策略。

3.3 基于患者記憶性T細(xì)胞的分析方法

有研究人員借助T細(xì)胞對腫瘤新生抗原具有特異性記憶的方法，建立了離體篩選腫瘤新生抗原的方法（見圖2）。 該方法的第一步也是利用計算機(jī)預(yù)測腫瘤新生抗原，然后將全部候選新生抗原的基因片段重組到大腸埃希菌中表達(dá)；同時收集患者的CD4+T和CD8+T細(xì)胞作為后續(xù)產(chǎn)生記憶應(yīng)答的細(xì)胞，將大腸埃希菌和體外誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞共孵育之后，與T細(xì)胞亞群隔夜孵育；以非免疫原性蛋白產(chǎn)生的背景分泌作為對照，通過比較候選新生抗原刺激下細(xì)胞因子的分泌來檢測新生抗原特異性記憶應(yīng)答，從而篩選出真正的新生抗原。

圖2 基于患者記憶性T細(xì)胞的分析方法原理示意圖Figure 2 Schematic diagram of analytical method based on patient memory T cells

這種基于患者記憶性T細(xì)胞的分析方法的優(yōu)勢是可以篩選到真正能夠在患者體內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)的腫瘤新生抗原。一項多中心Ⅰ/Ⅱa期在研臨床試驗（NCT03633110）的中期結(jié)果顯示，患者接受疫苗免疫后對99%的抗原肽具有免疫反應(yīng)，而依靠計算機(jī)預(yù)測獲得的候選抗原，免疫患者僅有60%的抗原肽具有免疫反應(yīng)[52]。

4 存在的問題與展望

高通量測序平臺的出現(xiàn)，加上多種生物信息學(xué)算法層出不窮，為檢測體細(xì)胞的遺傳改變和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的表型提供了獨特的機(jī)會，并利用這些研究結(jié)果進(jìn)行新一代的癌癥免疫治療。盡管如此，在腫瘤新生抗原預(yù)測與篩選方面但仍有很大的改進(jìn)空間。目前不斷有各種腫瘤新生抗原的預(yù)測工具被開發(fā)出來，但一些有益的工具尚未被納入分析工作流程。同時也存在由于缺乏有效預(yù)測工具，致使重要的因素沒有被考慮的情況，例如SNVs 和 Indels以外的一些變異類型已被證實為新生抗原來源，但在目前的預(yù)測管道中對它們幾乎沒有支持。

Ⅱ類HLA分型算法的低精度也阻礙了Ⅱ類新生抗原的廣泛預(yù)測。當(dāng)Ⅱ類HLA分型臨床數(shù)據(jù)可用時，應(yīng)該使用它們代替管道中的計算HLA預(yù)測，以提高預(yù)測的可靠性。由于MHCⅡ類新生抗原的結(jié)合親和性訓(xùn)練數(shù)據(jù)較少，且肽與MHC 結(jié)合復(fù)雜性增加，所以 MHCⅡ類新生抗原的算法也較少，限制了MHCⅡ類新生抗原表位的預(yù)測精度。通過目前的算法預(yù)測的肽庫仍需實驗的驗證才可以確定哪些新生抗原會引發(fā)免疫反應(yīng)，但實驗的時間和經(jīng)費成本較大，仍舊需要繼續(xù)尋找確定新生抗原的指標(biāo)。在腫瘤的免疫逃逸之下，新生抗原疫苗也面臨著誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞發(fā)揮作用有限的問題。

隨著對腫瘤和免疫學(xué)的進(jìn)一步探索，將會有更多的預(yù)測和篩選工具被開發(fā)出來，并納入到臨床前和臨床研究中，對腫瘤新生抗原的預(yù)測與篩選將會更加精準(zhǔn)，為腫瘤的個性化免疫治療提供有效的支持。