基于火焰原子發(fā)射光譜法血清鈉離子候選參考方法的建立

劉春龍，胡 月，薛利寧，任軼昆，孫 茜

(生化診斷試劑檢驗(yàn)技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176)

鈉離子是細(xì)胞外液如血液中最多的陽離子，對保持細(xì)胞外液容量、調(diào)節(jié)酸堿平衡、維持正常滲透壓和細(xì)胞生理功能具有重要意義，并參與維持神經(jīng)-肌肉的正常應(yīng)激性。細(xì)胞外液鈉濃度的改變可由水、鈉任一含量的變化而引起，所以鈉平衡紊亂常伴有水平衡紊亂。水與鈉的正常代謝及平衡是維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。因此，血清鈉的測定具有重要的臨床意義，尤其有助于電解質(zhì)紊亂的治療。然而，由于臨床常規(guī)檢驗(yàn)血清鈉離子的方法學(xué)較多，且不同方法學(xué)之間存在一定的差異，導(dǎo)致其測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化工作困難重重。近年以臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化為目的的量值溯源受到重視[1]。建立穩(wěn)定有效的參考方法對于促進(jìn)鈉離子檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化具有重要價(jià)值是行業(yè)內(nèi)共識。臨床檢驗(yàn)參考方法的主要作用是建立和評價(jià)常規(guī)方法的準(zhǔn)確性[2]。本研究基于火焰原子發(fā)射光譜法，嘗試建立一種穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度高(正確度和精密度良好)的血清鈉離子候選參考方法，為體外診斷廠家鈉離子常規(guī)測量系統(tǒng)向參考系統(tǒng)溯源提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1原料 氯化鈉GBW(E)060024C國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度99.97%)、濃硝酸(濃度15.4 mol/L)、氯化鉀(鈉含量≤0.02%)，均購自Sigma公司。

1.1.2儀器 島津AA-7000原子吸收分光光度計(jì)、哈密爾頓Microlab-500型稀釋配液儀、賽多利斯CP225D型電子天平、Eppendorf移液器。

1.2試劑配制

1.2.1總原則 所有與試劑、水或樣本接觸的玻璃或者塑料器皿均按下面的序列清洗：放在0.77 mol/L HNO3中浸泡60 min,然后用去離子水沖洗(至少6次)，最后在無塵環(huán)境中倒置自然干燥。

1.2.2配制步驟 (1)氯化鉀(KCl)稀釋液(KCl 4.5 mmol/L)：稱取0.336 g KCl，在轉(zhuǎn)移到1 000 mL容量瓶中，用去離子水定容，顛倒20次混勻。氯化鉀溶液作為鈉標(biāo)準(zhǔn)貯備液的稀釋液和空白貯備液使用。保存條件：2～8 ℃。(2)鈉標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取0.642 8、0.701 3、0.759 7、0.818 2、0.876 6和0.935 0 g干燥的編號為GBW(E)060024C的國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用氯化鉀稀釋液(4.5 mmol/L)定容，顛倒20次混勻。保存條件：2～8 ℃。(3)全部溶液都放至室溫，用稀釋配液儀按1∶100用水稀釋鈉標(biāo)準(zhǔn)貯備液和樣本。

1.3測量參數(shù) 島津AA-7000原子吸收分光光度計(jì)參數(shù)設(shè)置為波長589.5 nm、光譜帶寬0.2 nm、氣體類型Air-C2H2、燃?xì)饬髁?.8 L/min、燃燒頭高度7 mm。

1.4測量步驟 調(diào)零后測量從160 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液發(fā)射光相對強(qiáng)度，發(fā)射光相對強(qiáng)度值的重復(fù)性在±0.5%以內(nèi)，儀器達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。分別測量空白和標(biāo)準(zhǔn)液，并記錄它們的發(fā)射光相對強(qiáng)度值E(儀器自動(dòng)扣除空白)。用扣除空白后的發(fā)射光的相對強(qiáng)度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸系數(shù)r2應(yīng)大于0.999 0。用國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)909C評估方法的正確度，重復(fù)測量3次。用利德曼公司兩濃度工作校準(zhǔn)品評估方法的精密度，每天重復(fù)測量5次，連續(xù)3 d。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以濃度值為X軸，扣除空白后的發(fā)射光的相對強(qiáng)度值為Y軸，使用Excel2007軟件繪制線性回歸圖，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。國際參考實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證計(jì)劃(Rela)中鈉離子的合格標(biāo)準(zhǔn)為小于1.25%，計(jì)算國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)909C實(shí)測值與靶值的相對偏移，為保證所建立參考方法滿足Rela的要求，本研究制定相對偏移合格標(biāo)準(zhǔn)為小于1.00%；計(jì)算利德曼公司兩濃度工作校準(zhǔn)品實(shí)測值的總不精密度，依據(jù)利德曼公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，合格標(biāo)準(zhǔn)為小于1.50%。

2 結(jié) 果

2.1方法的線性 對該候選參考方法進(jìn)行優(yōu)化后，標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，線性方程為Y=0.001 240 7X+0.006 685 7，r2=0.999 2>0.999 0。

圖1 鈉離子標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2方法的正確度 國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)909C靶值為141.84 mmol/L，實(shí)測值與靶值偏移均小于1.0%，正確度驗(yàn)證通過，實(shí)測數(shù)據(jù)見表1。

2.3方法的精密度 利德曼公司高低兩濃度工作校準(zhǔn)品的總不精密度分別為0.57%和1.23%,兩者均小于1.50%，精密度驗(yàn)證通過，實(shí)測數(shù)據(jù)見圖2，圖中不同形狀的點(diǎn)分別代表3 d的精密度驗(yàn)證結(jié)果分布情況。

表1 鈉離子正確度

圖2 鈉離子精密度散點(diǎn)圖

2.4Rela Rela結(jié)果在等效限范圍內(nèi)，進(jìn)一步可證明所建方法的正確度和可靠性。回報(bào)結(jié)果見圖3，箭頭所標(biāo)示點(diǎn)為本實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，其他方框代表各測量結(jié)果的不確定度。

圖3 Rela鈉離子回報(bào)結(jié)果

3 討 論

準(zhǔn)確的臨床檢驗(yàn)結(jié)果，具有跨時(shí)空的可比性，是防病治病和提高人類健康水平的基本需要，也是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)界的工作目標(biāo)[3]。其中血清鈉離子的檢測由于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法有離子選擇性電極法、原子吸收分光光度法、火焰光度法、比色法和酶法等，不同的方法學(xué)之間存在一定的差異。血清鈉離子又是臨床醫(yī)生判斷電解質(zhì)紊亂情況的重要指標(biāo)，量值溯源被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化唯一而有效的途徑，而參考系統(tǒng)(包括參考物質(zhì)、參考測量程序、參考實(shí)驗(yàn)室)，尤其是參考測量程序在實(shí)現(xiàn)量值溯源過程中起到承上啟下的作用[4-5]。因此各體外診斷廠家有必要按臨床化學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(IFCC)的標(biāo)準(zhǔn)，建立血清鈉離子的參考方法。也可通過方法學(xué)比對的方法，將常規(guī)方法與之比較，以體現(xiàn)常規(guī)方法的正確度[6]。

火焰原子吸收光譜法被廣泛應(yīng)用于金屬元素的測定，測定簡便，結(jié)果可靠[7]。本研究建立的鈉離子候選參考方法基于火焰原子發(fā)射光譜法，將血清用去離子水采用稱重法準(zhǔn)確稀釋，進(jìn)行分析與測定。發(fā)射光譜法是測定被測定離子的發(fā)射光相對強(qiáng)度。樣品中的鈉原子接受火焰的熱能而被激發(fā)處于激發(fā)態(tài)。激發(fā)的原子不穩(wěn)定，立即發(fā)射出特定波長的光線，迅速回到基態(tài)。發(fā)射光線的強(qiáng)度與樣品中的鈉離子的濃度呈正比關(guān)系[8]。該研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于通過優(yōu)化火焰原子吸收光譜法的參數(shù)和流程建立了鈉離子參考方法，可作為鈉離子檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，為鈉離子的量值溯源工作提供了基礎(chǔ)。需要說明的是，該參考方法運(yùn)行成本較高，通量較小，不適用于臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)測量，建議在規(guī)范的醫(yī)學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行。該方法良好的精密度是實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的重要前提和基礎(chǔ)。如果不解決實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測量精密度問題，測量標(biāo)準(zhǔn)化則無從談起[9]。

參考方法的建立務(wù)必建立在對各個(gè)細(xì)節(jié)的嚴(yán)格確認(rèn)的基礎(chǔ)上。按照參考實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試劑配制，控制“人、機(jī)、料、法、環(huán)”[10-11]。本研究中儀器設(shè)備的狀態(tài)非常重要，如島津AA-7000使用前主機(jī)需預(yù)熱60 min以上，空心陰極燈需預(yù)熱30 min以上。確認(rèn)火焰狀態(tài)，調(diào)整分壓閥空氣壓力為0.35～0.38 MPa，乙炔氣瓶需調(diào)整壓力為0.09～0.10 MPa。檢查燃燒器，確認(rèn)預(yù)混合室和霧化器中潔凈無異物。吸入超純水后預(yù)熱機(jī)器10 min。文中所述制備溶液的物質(zhì)均指100%含量，若不足，應(yīng)按照純度進(jìn)行換算。選用稀釋配液儀對鈉標(biāo)準(zhǔn)貯備液和樣本進(jìn)行稀釋，可明顯提高測量的重復(fù)性水平。對于鈉濃度較高的樣品，會因稀釋倍數(shù)過大，降低測定的精密度，因此常選用次靈敏線測定[12]。

從理論上來講，各個(gè)醫(yī)院檢驗(yàn)科每日常規(guī)工作的結(jié)果，均應(yīng)溯源至參考系統(tǒng)的結(jié)果[13]。本文所建立的候選參考方法，仍需進(jìn)一步研究和完善，補(bǔ)充該方法的抗干擾、穩(wěn)健性等[14]。該法的建立可促進(jìn)血清鈉離子的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，為體外診斷廠家常規(guī)試劑盒的量值溯源提供了新的途徑[15]。同時(shí)，運(yùn)行該參考方法的實(shí)驗(yàn)室必須滿足ISO17025和ISO15195的基本要求[16-17]。

本研究成功建立了基于火焰原子發(fā)射光譜法的血清鈉離子候選參考方法，可極大地推進(jìn)血清鈉離子的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，為血清鈉離子試劑盒的量值溯源提供了保障。