IM患兒外周血單核細(xì)胞TLR2、TLR9及CD19+、CD23+表達(dá)水平及意義

孫 丹,李艷艷,田秀穎,錢 同

(徐州市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇徐州 221000)

傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)是發(fā)生在EBV感染之后常見(jiàn)的表現(xiàn)形式，作為兒童時(shí)期常見(jiàn)的感染性疾病之一，近年來(lái)發(fā)病率逐漸在增加[1]。有研究指出B細(xì)胞是EBV感染的最初靶細(xì)胞，在淋巴細(xì)胞中CD19+為B細(xì)胞，而CD19+和CD23+同時(shí)為陽(yáng)性即為永生B細(xì)胞，在EBV侵入機(jī)體后，Toll樣受體(TLRS)參與了該病毒病原體的識(shí)別，同時(shí)在EBV的感染及轉(zhuǎn)歸中起到了重要的作用，TLR2和TLR9是該受體的重要組成成分[2]。本研究將通過(guò)觀察IM患者外周血某些指標(biāo)在不同時(shí)期內(nèi)的變化并對(duì)其在IM發(fā)病過(guò)程中的作用進(jìn)行探究。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2018年1月本院兒科初治的IM患兒40例作為研究對(duì)象，40例IM患兒根據(jù)IM治療過(guò)程分期分為急性期組(初始發(fā)病至1周時(shí)間內(nèi))和恢復(fù)期組(初始發(fā)病期進(jìn)行治療后第25～30天)[3]，年齡2～13歲，平均(6.93±3.72)歲，其中男21例，女19例；納入標(biāo)準(zhǔn)：符合IM診斷的標(biāo)準(zhǔn)且均為初次發(fā)病且均無(wú)糖皮質(zhì)激素類藥物或細(xì)胞毒性藥物使用史。另選取同期在本院兒童保健門診進(jìn)行常規(guī)體檢的40例健康兒童作為對(duì)照組，年齡2～12歲，平均(7.09±4.11)歲，其中男22例，女18例；對(duì)照組均無(wú)發(fā)生變態(tài)反應(yīng)性疾病史和其他免疫性的疾病，各組在性別和年齡上比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。參與本次研究的患兒均簽署了知情同意書，且本研究均經(jīng)過(guò)了本院倫理學(xué)會(huì)討論通過(guò)。

1.2樣本采集處理 分別采集各組靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，樣本采集當(dāng)天后進(jìn)行B細(xì)胞流式細(xì)胞分析，分離的血漿進(jìn)行TLR2和TLR9熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析。

1.3指標(biāo)測(cè)定 采用CD19+和CD19+CD23+由美國(guó)BD公司提供的BD FACSCantoTM流式細(xì)胞儀器進(jìn)行測(cè)定。相應(yīng)的配套試劑也由該公司提供。TLR2和TLR9的mRNA測(cè)定采用美國(guó) ABI 公司7900 hT Fast Real-Time PCR System 型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀器進(jìn)行測(cè)定；其中引物由上海生物工程技術(shù)公司提供。Trizol 試劑盒購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó) ABI公司，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；根據(jù)參考基因進(jìn)行相對(duì)定量的ΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1各組CD19+和CD19+CD23+表達(dá)情況 通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，急性期組的CD19+和CD19+CD23+陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于恢復(fù)期組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);恢復(fù)期組的CD19+和CD19+CD23+陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組CD19+和CD19+CD23+陽(yáng)性表達(dá)率(%，±s)

注：與急性期組比較，#P<0.05；與恢復(fù)期組比較，*P<0.05

2.2各組TLR2mRNA和TLR9mRNA表達(dá)水平情況 急性期組TLR2mRNA和TLR9mRNA表達(dá)水平顯著高于恢復(fù)期組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);恢復(fù)期組的TLR2mRNA和TLR9mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組TLR2mRNA和TLR9mRNA表達(dá)水平±s)

注：與急性期組比較，#P<0.05；與恢復(fù)期組比較，*P<0.05

3 討 論

IM是由EBV感染所致。有研究指出淋巴B細(xì)胞的表面存在EBV的特異性受體，所以淋巴B細(xì)胞也成了該病毒持續(xù)感染的終身潛伏場(chǎng)所。在EBV細(xì)胞感染B細(xì)胞后可以逃避免疫的監(jiān)視過(guò)程，為建立持續(xù)性感染的B細(xì)胞庫(kù)提供了機(jī)會(huì)，在細(xì)胞免疫功能低下的時(shí)候，造成了永生B細(xì)胞不斷地繁殖[4-5]。CD19+分子是B細(xì)胞表面的糖基化的跨膜蛋白，是B細(xì)胞表面的特異性蛋白，該蛋白水平直接代表了B細(xì)胞的水平。CD23+是主要在活化的B細(xì)胞表面表達(dá)的跨膜蛋白，可以作為B細(xì)胞活化的重要標(biāo)志物，當(dāng)CD19+分子和CD23+同時(shí)陽(yáng)性時(shí)代表永生B細(xì)胞[6-7]。對(duì)于CD19+和CD23+兩個(gè)分子水平的測(cè)定，是對(duì)IM患兒外周血B細(xì)胞和永生B細(xì)胞水平的較好的反應(yīng)[8]。在B細(xì)胞活化的過(guò)程中與B細(xì)胞表面的抗體是密不可分的，其中Toll樣受體提供了B細(xì)胞活化的途徑。最主要的兩種是TLR2和TLR9。TLR2能夠較多地識(shí)別配體，在EBV感染時(shí)是參與到免疫應(yīng)答的直接受體，能夠直接地刺激B細(xì)胞激活，在EBV感染的時(shí)候能夠刺激炎癥因子的產(chǎn)生繼發(fā)相應(yīng)的病理反應(yīng)[9-10]。 TLR9能夠被EBV病毒的DNA基序所激活，能夠促進(jìn)B細(xì)胞的激活，促進(jìn)其增殖和活化，活化后的TLR9又能反過(guò)來(lái)上調(diào)TLR9。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)有證實(shí)，在抗病毒的免疫應(yīng)答中TLR9具有積極的作用[11]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，在急性期組的CD19+和CD19+CD23+的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于恢復(fù)期，在感染的急性期，病毒入侵B細(xì)胞，在細(xì)胞表面的受體就會(huì)對(duì)抗原進(jìn)行識(shí)別和提呈給免疫細(xì)胞，引起體內(nèi)的免疫反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)感染了EBV病毒的B細(xì)胞進(jìn)行殺滅[11]。所以體內(nèi)CD19+和CD19+CD23+陽(yáng)性表達(dá)率就會(huì)下降，相對(duì)而言，急性期的下降幅度和數(shù)量要顯著高于恢復(fù)期的患兒。而處于恢復(fù)期的患兒上述指標(biāo)表達(dá)水平也要低于對(duì)照組。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，急性期組的TLR2mRNA和 TLR9mRNA水平要顯著高于對(duì)照組，且急性期組的二者要顯著高于恢復(fù)期組，Toll樣受體作為一種跨膜的信號(hào)傳遞受體，在識(shí)別入侵性的病原微生物中發(fā)揮著重要的作用[12-13]。在 IM 的急性期，TLR2 通過(guò)機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，限制 EB 病毒的傳播和表達(dá)，TLR9 識(shí)別 EBV且限制其傳播并控制已被病毒感染的潛伏 B 細(xì)胞而發(fā)揮作用[14]。在病原體侵入機(jī)體后，機(jī)體通過(guò)上調(diào)TLR2mRNA和 TLR9mRNA來(lái)更全面地識(shí)別和更迅速地提呈給免疫細(xì)胞，進(jìn)行機(jī)體免疫反應(yīng)[15]。在疾病處于恢復(fù)期時(shí)，TLR2與TLR9的配體對(duì)TLR2與TLR9的刺激作用減少，從而二者的mRNA表達(dá)下調(diào)。

4 結(jié) 論

IM患兒的外周血單核細(xì)胞TLR2、TLR9及CD19+、CD23+各分子指標(biāo)在IM的患者的不同時(shí)期表達(dá)水平不同，這些指標(biāo)可能參與了IM的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的全過(guò)程。