IMP3、P16蛋白、HE4、P53蛋白在卵巢漿液性腫瘤中表達(dá)及其臨床意義

趙長燕，賀紅梅，邵長好，白金猛

(河北省秦皇島市婦幼保健院：1.病理科；2.婦科，河北秦皇島066000；3.河北省秦皇島市第一醫(yī)院麻醉科，河北秦皇島066000)

卵巢漿液性腫瘤是目前臨床最為常見的一種卵巢腫瘤，卵巢惡性腫瘤患者中約有40%為卵巢漿液性腫瘤，其病死率及復(fù)發(fā)率均非常高。國外學(xué)者認(rèn)為可將卵巢漿液性癌劃分為兩個級別，即低級別和高級別[1]。也有學(xué)者認(rèn)為卵巢漿液性癌的不同的兩條發(fā)生機(jī)制，即二元論發(fā)生機(jī)制[2]，該機(jī)制同兩級分級系統(tǒng)相吻合。目前普遍認(rèn)為低級別卵巢漿液性癌(1 型癌)是良性腫瘤通過轉(zhuǎn)化成交界性腫瘤，然后發(fā)展為癌[3]。但是，目前還未明確何種生物學(xué)指標(biāo)能夠鑒別低級別卵巢漿液性癌和交界性卵巢漿液性腫瘤，已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)高級別與低級別卵巢漿液性癌在分子水平及組織學(xué)方面存在一定差異[4]。但從免疫組化方面對比分析二者蛋白水平差異的報道很少。胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA 結(jié)合蛋白3 (IMP3)基因是胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA 結(jié)合蛋白家族的成員之一，是一種新是別的癌胚蛋白[5]。同樣，P16蛋白、P53蛋白和人附睪蛋白4(HE4)均是近期備受關(guān)注的卵巢腫瘤標(biāo)志物[6]。本研究旨在通過分析IMP3、P16蛋白、HE4、P53 蛋白在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)水平，為其在卵巢漿液性腫瘤診斷和評估中的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2010年11月至2017年11月本院病理科存檔的卵巢漿液性囊腺瘤石蠟標(biāo)本204例(良性組)，卵巢交界性漿液性腫瘤石蠟標(biāo)本42例(交界性組)，卵巢漿液性癌石蠟標(biāo)本64例(惡性組)作為研究對象。其中卵巢漿液性癌患者中盆腔淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移48例，有轉(zhuǎn)移16例；組織學(xué)分級參照兩級分級相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)將其分為低級別27例，高級別37例[7]；根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2009年相關(guān)分期標(biāo)準(zhǔn)[8]，可將其分為Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期29例。入組患者手術(shù)治療前均沒有放療、化療經(jīng)歷，由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師完成所有標(biāo)本蘇木精-伊紅(HE)染色切片復(fù)診。收集全部標(biāo)本對應(yīng)患者臨床資料，且所有患者及其家屬均詳細(xì)了解研究內(nèi)容，自愿簽署了知情同意書，研究已通過倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 兔抗人IMP3單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠抗人P16蛋白單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠抗人P53蛋白單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠抗人HE4單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3免疫組化染色方法 連續(xù)切片所有患者石蠟標(biāo)本，切片厚度均為4 μm，每個標(biāo)本切片8張，并貼在潔凈載玻片上，放置烤片機(jī)70 ℃烘烤40 min，實驗所用全部標(biāo)本均進(jìn)行HE和免疫組織化學(xué)染色(SP法)，均行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色，DAB顯色劑滴加時間統(tǒng)一，并置于顯微鏡觀察，目標(biāo)部位一旦有棕黃色顆粒顯現(xiàn)，立即統(tǒng)一時間采用蒸餾水終止顯色。具體操作步驟均嚴(yán)格參照試劑盒說明書完成，陽性對照選擇已知陽性標(biāo)本切片，陰性對照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1IMP 3和HE4判定方法 選擇染色清晰且典型區(qū)域，在高倍視野(×400)下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)100個細(xì)胞，統(tǒng)計陽性細(xì)胞比例，最終數(shù)據(jù)采用5個視野陽性比例均值，著色評分分別由2為資深病理醫(yī)師各自獨立完成并取其均值。參考以下判定標(biāo)準(zhǔn)[9]：綜合陽性細(xì)胞占比及染色深淺進(jìn)行積分；根據(jù)細(xì)胞著色程度：未發(fā)現(xiàn)明顯著色記0分，著色呈現(xiàn)淺黃色記1分，著色表現(xiàn)為棕黃色記2分，著色為棕褐色記3分。對兩項評分并進(jìn)行分級：低于1分記(-)，2分記(+)，3分或4分記(++)，大于4分記(+++)。(+)表示標(biāo)本腫瘤標(biāo)記物觀察結(jié)果為陽性，(-)表示為陰性。陽性細(xì)胞表達(dá)率=[(+)例數(shù)+(++)例數(shù)+(+++)例數(shù)]/總例數(shù)×100%。

1.4.2P16和P53蛋白判定方法 P16蛋白陽性染色集中在細(xì)胞漿，而P53蛋白陽性集中在細(xì)胞核，均表現(xiàn)為棕黃色，視野選擇同上，根據(jù)細(xì)胞著色程度：未發(fā)現(xiàn)明顯著色記0分，著色呈現(xiàn)淺黃色記1分，著色表現(xiàn)為棕黃色記2分，著色為棕褐色記3分；根據(jù)陽性細(xì)胞百分比：10%以內(nèi)(包括10%)記0分，比例在11～25%記1分，比例在26～50%記2分，比例在50%以上(不包括50%)記3分。兩項評分乘積結(jié)果：0分記(-)，1、2、3分記(+)，4、5、6、7分記(++)，8、9分記(+++)，其中1～9分均代表陽性細(xì)胞。陽性細(xì)胞表達(dá)率=陽性細(xì)胞例數(shù)/總數(shù)×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計數(shù)資料采用百分比(%)表示，行χ2檢驗；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MP3、P16蛋白、HE4和P53蛋白在卵巢漿液性腫瘤組織中的表達(dá)情況 IMP3陽性表達(dá)率在良性組和交界性組、良性組和惡性組、交界性組和惡性組中比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=31.824、80.087、3.944；P<0.05)；良性組P16蛋白陽性表達(dá)率與交界性組、惡性組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=35.908、78.650；P<0.05)。良性組HE4陽性表達(dá)率與交界性組、惡性組中比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=33.995，52.283；P<0.05)。P53蛋白陽性表達(dá)率在良性組和惡性組、交界性組和惡性組中比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=56.913、17.872；P<0.05)。見表1。

2.2卵巢漿液性癌組織臨床病理特征同IMP3、P16蛋白、HE4和P53蛋白陽性表達(dá)關(guān)系 Ⅲ或Ⅳ期患者IMP3陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.672、 9.136，P<0.05)；在卵巢漿液性癌組織低級別中IMP3陽性表達(dá)率顯著高于高級別組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.147，P<0.05)。FIGO臨床各分期中P16蛋白陽性表達(dá)率與HE4陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.804，P>0.05)，HE4陽性表達(dá)率在盆腔淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者中明顯高于無轉(zhuǎn)移者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.000，P<0.05);HE4陽性表達(dá)率在低級分化組織中明顯高于高級分化組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.805，P<0.05)。P53蛋白陽性表達(dá)率在高級分化組織中明顯高于低級分化組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.163，P<0.05)。見表2。

2.3IMP3、P16蛋白、HE4和P53蛋白在卵巢漿液性腫瘤組織中的表達(dá)染色情況 在卵巢漿液性腫瘤組織中，IMP3、HE4和P53蛋白陽性表達(dá)顯微鏡觀察棕黃色顆粒均主要呈現(xiàn)在胞漿內(nèi)，顏色較背景染色明顯加深，胞核著色均不明顯；在癌組織中，P16蛋白陽性表達(dá)顯微觀察在胞漿和胞核中均十分明顯，在交界性漿液性腫瘤中僅在胞漿中呈現(xiàn)明顯陽性。見圖1。

表1 IMP3、P16蛋白、HE4和P53蛋白在卵巢漿液性腫瘤組織中的表達(dá)比較

注：與良性組比較,*P<0.05；與交界性組比較,#P<0.05

表2 卵巢漿液性癌組織各蛋白陽性表達(dá)率比較[n(%)]

注：與Ⅰ、Ⅱ期比較，*P<0.05；與盆腔結(jié)淋巴無轉(zhuǎn)移比較，&P<0.05；與高級分化組織比較，#P<0.05

注：A為IMP3表達(dá)；B為P16蛋白表達(dá)；C為HE4表達(dá)；D為P53蛋白表達(dá)；1、2、3分別為卵巢漿液性囊腺瘤、卵巢交界性漿液性腫瘤和卵巢漿液性癌

圖1 IMP3、P16蛋白、HE4和P53蛋白在3組卵巢漿液性腫瘤組織中的表達(dá)

2.4各指標(biāo)檢測對卵巢漿液性囊腺癌診斷效能的比較 四項指標(biāo)聯(lián)合檢測卵巢漿液性囊腺癌靈敏度為92.19%，顯著高于IMP3和P16蛋白單項檢測(χ2=36.288、38.137；P=0.000、0.000)，特異度為96.88%，顯著高于IMP3和P16蛋白單項檢測(χ2=24.380、41.400；P=0.000、0.000)。見表3。

表3 各指標(biāo)檢測對卵巢漿液性囊腺癌靈敏度和特異度比較(%)

圖2 IMP3、P16蛋白、HE4和P53蛋白單檢與聯(lián)合檢測的ROC曲線分析

2.5IMP3、P16蛋白、HE4和P53蛋白單檢與聯(lián)合檢測的ROC曲線分析 IMP3、P16蛋白、HE4和P53蛋白單檢與聯(lián)合檢測的ROC曲線見圖2，曲線下面積依次為0.749、0.679、0.816、0.631、0.869，聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積最高，其次為P53蛋白(P<0.05)。

3 討 論

卵巢癌是嚴(yán)重危害婦女生命安全的一種常見惡性腫瘤，其發(fā)病率位居婦科惡性腫瘤第三，其中最常見的為卵巢漿液性腫瘤，及早發(fā)現(xiàn)并積極治療是改善患者生活質(zhì)量和提高其生存率最為有效的方式。但卵巢位置較深，且癥狀體征并不明顯，在早期病變時難以發(fā)現(xiàn)，使得七成左右患者在晚期時才會確診[10]，因此，如何有效提升卵巢漿液性癌早期檢出率迫在眉睫。

IMP3能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的、黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移產(chǎn)生促進(jìn)作用，和許多晚期或者已發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤密切相關(guān)，可以作為胃癌、卵巢癌、前列腺癌等的診斷標(biāo)志物[11]。ELBALAT 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者中IMP3表達(dá)異常升高，其陽性表達(dá)不僅同組織學(xué)分級和FIGO臨床分期有關(guān)，同卵巢癌總體生存率也有密切關(guān)系，推測IMP3在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中均發(fā)揮重要作用，有望成為卵巢癌患者預(yù)后判斷的重要蛋白因子。本研究通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)IMP3在卵巢漿液性癌中的陽性表達(dá)率顯著高于卵巢交界性漿液性腫瘤，而卵巢交界性漿液性腫瘤中的陽性表達(dá)率又顯著高于卵巢漿液性囊腺瘤，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。為了更進(jìn)一步了解IMP3在卵巢漿液性癌組織中的表達(dá)情況，本研究還表明，其陽性表達(dá)同卵巢漿液性癌FIGO臨床分期和組織學(xué)分級密切相關(guān)，Ⅲ、Ⅳ期患者陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ期或Ⅱ期患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，雖然與盆腔淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)，但在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移患者中陽性表達(dá)率要高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者。以上結(jié)果均提示IMP3在卵巢漿液性癌發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，但具體機(jī)制尚不明確，有待后期深入研究。

P16基因是一種能夠抑制多種腫瘤的基因，人類腫瘤細(xì)胞中有一半均存在P16基因純合子突變或缺失，因此有學(xué)者認(rèn)為P16基因失靈將造成細(xì)胞惡性增殖，進(jìn)而引發(fā)惡性腫瘤，目前已在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)P16基因存在突變或缺失情況[13]。因此，推測P16蛋白陽性表達(dá)對腫瘤預(yù)后判斷和腫瘤易感性判斷具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，IMP3在良性組、交界性組和惡性組中的陽性表達(dá)率分別為32.35%、69.05%和85.94%，該結(jié)果同其他研究保持一致[14]。且本研究中免疫組化染色結(jié)果表明，P16蛋白在卵巢漿液性癌組織胞核和胞漿內(nèi)均表達(dá)，但在交界性腫瘤組織中均在胞漿內(nèi)表達(dá)，其在卵巢漿液性腫瘤中失活具體機(jī)制尚不明確。

HE4目前已被論證在卵巢癌組織中存在高表達(dá)現(xiàn)象，有望成為卵巢癌的一種高特異度和靈敏度的腫瘤標(biāo)記物[15]。正常情況下，HE4在卵巢組織中基本無表達(dá)；在大部分非卵巢惡性囊腺瘤組織中低表達(dá)或無表達(dá)，但在卵巢囊腺癌中往往存在高表達(dá)。本研究結(jié)果表明，HE4在卵巢漿液性癌組織中陽性表達(dá)率高達(dá)75.00%，顯著高于卵巢漿液性囊腺瘤,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明HE4高表達(dá)可能以某種方式，促使卵巢上皮細(xì)胞癌變，在卵巢漿液性癌發(fā)生過程中起到重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，HE4陽性表達(dá)率隨盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期進(jìn)展而上升，但隨卵巢漿液性癌組織分化程度增加而下降，該結(jié)果與其他研究結(jié)果保持一致[16]。因此推測，HE4同卵巢漿液性癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲等密切相關(guān)，但具體通過何種機(jī)制參與，因目前國內(nèi)外相關(guān)報道甚少，還需進(jìn)一步深入研究。

P53基因是目前為止發(fā)現(xiàn)的同人類腫瘤最為密切相關(guān)的一種基因，若發(fā)生基因突變導(dǎo)致P53基因喪失正常功能，將極易導(dǎo)致細(xì)胞癌變[17]。本研究結(jié)果表明，P53蛋白在盆腔淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移中高于無轉(zhuǎn)移，在高級分化組織中明顯高于低級分化組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示卵巢漿液性癌高級別同低級別發(fā)生機(jī)制不同，而卵巢漿液性癌低級別同卵巢交界性漿液性腫瘤及卵巢漿液性囊腺瘤發(fā)病機(jī)制可能相似。這同卵巢漿液性癌兩級分級學(xué)說相符。也進(jìn)一步說明P53蛋白陽性表達(dá)同腫瘤分化程度密切相關(guān)，但同交界性漿液性腫瘤發(fā)生不具有明顯相關(guān)性，從而證實二者發(fā)病機(jī)制不同。此外，也提示P53蛋白免疫組化檢測是區(qū)分卵巢漿液性癌分化級別的一種性價比較高的輔助手段。

4 結(jié) 論

IMP3、P16蛋白、HE4和P53蛋白聯(lián)合檢測能夠提升臨床卵巢漿液性癌的診斷率，有望成為卵巢漿液性癌檢測的良好指標(biāo)。