血清AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT聯(lián)合檢測(cè)在肝癌中的診斷價(jià)值研究

趙宗晨，董振芳，鞠 瑛，許 瑞

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，山東濟(jì)南 250021)

原發(fā)性肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)[1]，肝癌早期無(wú)典型癥狀，大多數(shù)患者診斷肝癌已經(jīng)是中晚期，而且預(yù)后較差，因此提高肝癌的早期診斷尤為重要。甲胎蛋白(AFP)是最廣泛用于檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌診斷和檢測(cè)的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物，但是因其靈敏度和特異度不高，以AFP單個(gè)指標(biāo)作為臨床診斷依據(jù)時(shí)容易出現(xiàn)漏診且無(wú)法滿(mǎn)足臨床需求[2-3]。近年來(lái)一種新的腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白異質(zhì)體3(AFP-L3)被臨床應(yīng)用，部分研究表明AFP-L3對(duì)早期肝細(xì)胞肝癌診斷較有效[4]。另外，許多研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導(dǎo)蛋白(PIVKA-Ⅱ)對(duì)臨床診斷肝癌具有較高的特異性[5]。在臨床上常規(guī)的肝功能指標(biāo)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)方便快捷且費(fèi)用低，在臨床上應(yīng)用廣泛。本研究通過(guò)檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌與肝硬化患者的AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT表達(dá)水平，對(duì)比肝細(xì)胞肝癌與肝硬化陰陽(yáng)性患者在性別、年齡、腫瘤直徑、脈管內(nèi)癌栓、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)等各方面的差異，探討其獨(dú)立及聯(lián)合檢測(cè)在肝細(xì)胞肝癌中的診斷價(jià)值，并進(jìn)一步探究四者與病理分型之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年9月至2017年9月山東省立醫(yī)院就診的肝病患者174例，其中原發(fā)性肝癌的患者89例作為研究組，年齡為35～81歲，研究組患者均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)診斷，并且取樣時(shí)均未進(jìn)行治療；肝硬化未合并肝癌患者85例作為對(duì)照組，年齡為30～77歲。另選取本院體檢健康者80例作為健康對(duì)照組，年齡為34～83歲。

1.2方法

1.2.1AFP-L3的分離 AFP-L3親和吸附離心管及所需洗脫液等由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供。AFP-L3的分離采用微量離心柱法，離心柱內(nèi)裝有耦聯(lián)了小扁豆凝集素(LCA)的瓊脂糖作為親和介質(zhì)，可以特異結(jié)合AFP-L3。操作步驟：將研究對(duì)象血清400 μL加入600 μL清洗液，混勻后將已經(jīng)稀釋好的600 μL血清加入到耦聯(lián)了LCA的瓊脂糖離心柱中，當(dāng)血清流過(guò)離心柱時(shí)，與LCA結(jié)合力強(qiáng)的AFP-L3就會(huì)留在離心柱中，使用清洗液洗去不結(jié)合的AFP，最后經(jīng)專(zhuān)用洗脫液洗脫后，即獲得處理后的標(biāo)本，此標(biāo)本中含有較純的AFP-L3。

1.2.2檢測(cè)方法 采用羅氏公司E601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒均為羅氏公司配套產(chǎn)品，抽取3組受試者3 mL清晨空腹靜脈血，離心后分離血清，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程及試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定質(zhì)控品及受試者血清中的AFP及AFP-L3。使用日本富士公司LumipulseG1200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)PIVKA-Ⅱ的水平，檢測(cè)試劑盒均為富士公司配套產(chǎn)品。使用AU5800檢測(cè)GGT的水平，GGT 試劑盒為貝克曼庫(kù)爾特有限公司提供。所有實(shí)驗(yàn)質(zhì)控均在控。

1.2.3結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) AFP/AFP-L3=AFP-L3×2.5/總AFP×100%，該比例≥10%為陽(yáng)性[6]，AFP>20 ng/mL為陽(yáng)性，PIVKA-Ⅱ>40 ng/mL為陽(yáng)性[7]，GGT>50 U/L為陽(yáng)性[8]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以率表示，兩組組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；兩組組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；采用受試者工作特征曲線(xiàn)(ROC曲線(xiàn))分析各指標(biāo)對(duì)肝細(xì)胞肝癌的診斷價(jià)值,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組外周血AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT檢測(cè)結(jié)果比較 研究組AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ指標(biāo)均高于對(duì)照組及健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究組GGT高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.2外周血AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT的ROC曲線(xiàn)分析 ROC曲線(xiàn)越靠近左上角，表明其越接近最佳閾值診斷價(jià)值越高，四項(xiàng)指標(biāo)對(duì)肝細(xì)胞肝癌的診斷性能見(jiàn)圖1及表2。ROC曲線(xiàn)分析曲線(xiàn)下面積(AUC)顯示，PIVKA-Ⅱ高于AFP、GGT、AFP/AFP-L3。

2.3四項(xiàng)指標(biāo)陰陽(yáng)性患者間性別、年齡、腫瘤直徑、脈管內(nèi)癌栓及HBsAg比較 AFP陽(yáng)性患者與陰性患者在肝內(nèi)脈管癌比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在性別、年齡、腫瘤直徑、HBsAg比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AFP/AFP-L3陽(yáng)性患者與陰性患者在腫瘤直徑、脈管內(nèi)癌栓、HBsAg比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PIVKA-Ⅱ陽(yáng)性患者與陰性患者在性別、腫瘤直徑、脈管內(nèi)癌栓、HBsAg比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。GGT陽(yáng)性患者與陰性患者腫瘤直徑及脈管內(nèi)癌栓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；性別、年齡、HBsAg比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

圖1 AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT的ROC曲線(xiàn)分析

組別AFP(ng/mL)AFP/AFP-L3(%)PIVKA-Ⅱ(ng/mL)GGT(U/L)研究組21.97(5.74,495.55)2.5(2.5,87.34)338(42.45,2 581)50(28,103)對(duì)照組4.045(2.41,9.92)2.5(2.5,2.5)18(14,26)40(23.5,90)健康對(duì)照組2.6(1.9,3.9)2.5(2.5,2.5)16.9(7.25,23.26)20(15,27.75)χ2/t1-5.352-5.902-8.297-1.244P1<0.05<0.05<0.050.213χ2/t2-8.044-6.536-9.512-7.789P2<0.05<0.05<0.05<0.05

注：中位數(shù)(四分位數(shù))，χ2/t1、P1為研究組與對(duì)照組比較；χ2/t2、P2為研究組與健康對(duì)照組比較

表2 AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT對(duì)肝細(xì)胞肝癌診斷性能指標(biāo)

表3 AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ、GGT陰陽(yáng)性患者各指標(biāo)比較(n)

續(xù)表3 AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ、GGT陰陽(yáng)性患者各指標(biāo)比較(n)

3 討 論

肝細(xì)胞肝癌在我國(guó)屬于較常見(jiàn)的惡性腫瘤，因癌細(xì)胞侵襲性強(qiáng)、惡性程度高、病程進(jìn)展快等特點(diǎn)，往往治療效果不佳，病死率較高。因患者早期癥狀不明顯，明確診斷時(shí)多處于晚期，并且發(fā)病率和病死率居高不下，因此提高肝細(xì)胞肝癌患者的檢測(cè)率對(duì)肝癌患者尤為重要。目前臨床上主要是通過(guò)病理學(xué)、影像學(xué)及組織活檢對(duì)肝細(xì)胞肝癌進(jìn)行確診，GGT是診斷肝膽疾病及靈敏的指標(biāo)，在肝細(xì)胞肝癌中也成大量表達(dá)，可連同AFP及一些新的肝癌腫瘤標(biāo)志物用于肝癌的輔助診斷[9-10]。較為常見(jiàn)的血清腫瘤標(biāo)志物有AFP、癌胚抗原(CEA)、CA125、AFP-L3，PIVKA-Ⅱ等，單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物存在假陰性和假陽(yáng)性的問(wèn)題從而導(dǎo)致診斷靈敏度和特異度不高，因此臨床上多采用聯(lián)合檢測(cè)的方式來(lái)提高肝細(xì)胞肝癌的檢出率[11]。

肝細(xì)胞及卵黃囊細(xì)胞合成分泌的AFP是一類(lèi)糖原蛋白，主要是在胚胎時(shí)期合成，其他時(shí)期不合成或合成量微小，通常作為臨床上首選的血清腫瘤標(biāo)志物，為肝細(xì)胞肝癌的臨床診斷做出了巨大貢獻(xiàn)。另外，肝癌細(xì)胞可特異性產(chǎn)生AFP-L3，表現(xiàn)出早期血管浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移趨勢(shì)，且AFP-L3的比例與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，AFP-L3不僅對(duì)于原發(fā)性肝癌的早期診斷和良惡性鑒別具有很高的臨床價(jià)值，還可作為肝癌的預(yù)后指標(biāo)[12]。PIVKA-Ⅱ是肝臟合成的無(wú)凝血活性的異常凝血酶原，研究表明PIVKA-Ⅱ產(chǎn)生機(jī)制可能與患者肝臟維生素K代謝異常、γ-羧基凝血酶原轉(zhuǎn)錄后表達(dá)異常和過(guò)多的凝血酶原前體產(chǎn)生有關(guān)[13]。由表1的結(jié)果證明研究組AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這與秦燕等[14]研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示肝細(xì)胞肝癌及肝硬化患者的AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT均呈高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同一個(gè)腫瘤標(biāo)志物往往會(huì)出現(xiàn)不同部位、性質(zhì)的腫瘤患者血清中出現(xiàn)交叉現(xiàn)象，同一個(gè)腫瘤標(biāo)志物在不同腫瘤性質(zhì)中表達(dá)的程度不同，表2的結(jié)果顯示4者單獨(dú)運(yùn)用中PIVKA-Ⅱ具有最好的AUC，其診斷性和特異度優(yōu)于AFP，這與其他研究結(jié)果一致[15]。AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT聯(lián)合運(yùn)用顯示最高的AUC。表3的結(jié)果顯示AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT在肝癌脈管癌患者與非脈管癌患者中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT為臨床區(qū)分脈管癌患者提供了重要的參考價(jià)值。另外，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ、GGT與肝細(xì)胞肝癌的大小有關(guān)，三者隨著腫瘤直徑的增大而提高，這也與司元全等[16]報(bào)道的AFP/AFP-L3與肝細(xì)胞肝癌的大小有關(guān)相一致。我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，以往通常認(rèn)為乙型肝炎病毒感染與原發(fā)性肝癌沒(méi)有關(guān)聯(lián)。但是隨著臨床研究的不斷深入，大多數(shù)證據(jù)表明，原發(fā)性肝癌主要誘發(fā)因素是乙型肝炎病毒感染[17]。本研究結(jié)果顯示，各組AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ與HBsAg比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，由此充分說(shuō)明了AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乙型肝炎HBsAg陽(yáng)性肝癌具有較高的診斷價(jià)值。PIVKA-Ⅱ陽(yáng)性肝癌患者與陰性肝癌患者性別比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，也與先前研究表明我國(guó)肝細(xì)胞肝癌患者中男性患者明顯高于女性患者結(jié)果相一致[18]。

4 結(jié) 論

AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT聯(lián)合檢測(cè)能夠明顯提高肝細(xì)胞肝癌的檢測(cè)率，并且AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT在評(píng)價(jià)腫瘤大小及脈內(nèi)癌栓時(shí)也具有重要指導(dǎo)意義。同時(shí)也能更好地為HBsAg陽(yáng)性患者為臨床提供重要的參考價(jià)值。