膠體金技術(shù)在免疫學(xué)檢測中的應(yīng)用

曹 雷 王增國 崔曉辰 胡士林

（①山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061 ②濰坊科瑞斯生物科技有限公司 山東 濰坊）

膠體金技術(shù)是80年代首先于免疫學(xué)領(lǐng)域發(fā)展起來的一門新技術(shù)。最初該方法僅用于免疫電鏡技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到被動(dòng)凝集試驗(yàn)、光鏡染色、免疫印跡、免疫斑點(diǎn)滲濾法、免疫層析技術(shù)、生物傳感器、PCR技術(shù)及染色體的基因定位的檢測等生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。目前已廣泛應(yīng)用于臨床診斷，對(duì)醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)、食品加工等產(chǎn)生了巨大影響。該方法最大特點(diǎn)是簡單快速、準(zhǔn)確直觀，特別適合于廣大基層單位、醫(yī)院、野外作業(yè)人員以及大批量時(shí)間緊的檢測和大面積普查等，因此該技術(shù)具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景?，F(xiàn)將膠體金技術(shù)在某些領(lǐng)域的主要應(yīng)用做一綜述，希望能夠給從事相關(guān)研究的工作者提供一些幫助。

1 膠體金技術(shù)基本原理

（1）在還原劑作用下，氯金酸(HAuCl4)水溶液中的金離子被還原成金原子，并聚集成一定大小的納米金(nanogold)顆粒，在其表面吸附有負(fù)離子(AuCl2)和部分正離子(H+)形成吸附層，依靠靜電作用形成穩(wěn)定的膠體溶液，故稱為膠體金。膠體金標(biāo)記技術(shù)的物理基礎(chǔ)是還原得到的金原子具有特殊的電子結(jié)構(gòu)，在一些特殊的晶體面上存在著表面電子態(tài)，其費(fèi)米能級(jí)恰好位于體能帶結(jié)構(gòu)沿該晶面的禁帶之中，形成只能平行于表面方向運(yùn)動(dòng)的二維電子云[1]，使得膠體金顆粒具有高電子密度、介電特性、二次電子發(fā)射能力和催化作用等。金標(biāo)過程實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程，其原理一般認(rèn)為是在pH值等于或稍偏堿于蛋白質(zhì)等點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)呈電中性，此時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒之間靜電作用較小，而蛋白質(zhì)分子的表面張力卻最大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，較易吸附于膠體金顆粒表面形成蛋白層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，從而使膠體系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。（2）關(guān)于膠體金的制備已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道，其中最著名的是1857年Faraday等制備的金溶液歷時(shí)幾十年而穩(wěn)定。目前比較經(jīng)典的膠體金制備方法是檸檬酸鈉還原法、抗敗血酸還原法、白磷還原法等。還原劑的種類及濃度決定了金顆粒的粒徑大小。JAN W.SLOT等通過制備PA/Au探針對(duì)上述三種方法進(jìn)行比較，論證了還原劑、膠體金顆粒大小及實(shí)驗(yàn)效果之間的關(guān)系[2]。1971年，F(xiàn)aulk等將膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合制成用于電子顯微鏡的金探針[3]，是膠體金應(yīng)用于免疫細(xì)胞和組織化學(xué)的重要里程碑。此后膠體金逐漸應(yīng)用于免疫化學(xué)，形成了四大免疫標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素、酶和膠體金)之一的膠體金標(biāo)記技術(shù)，并得到廣泛應(yīng)用。

2 膠體金技術(shù)概況

人們對(duì)膠體金的研究已有四百多年的歷史，1857年Faraday等研究發(fā)現(xiàn)在膠體金溶液中加入少量電解質(zhì)，溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色，最終凝聚為無色，而加入明膠等大分子物質(zhì)后便可以阻止該變化。這一重大發(fā)現(xiàn)奠定了膠體金應(yīng)用的科學(xué)基礎(chǔ)。1939年Kausche等用金顆粒吸附煙草花葉病毒并在電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)金離子呈高電子密度，之后Feldherr等于1962年首次提出膠體金可以作為電子顯微鏡的示蹤標(biāo)志物。1971年Faulk WP等用膠體金標(biāo)記兔抗沙門氏菌血清，直接用于免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測沙門氏菌的表面抗原，開創(chuàng)了膠體金標(biāo)記技術(shù)。1974年Romano等通過金標(biāo)二抗(馬抗人IgG)建立了間接免疫金染色法。此后，膠體金標(biāo)記技術(shù)迅速發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于各種生物大分子在細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)部的定位、定性、形態(tài)發(fā)生和抗原特性等研究。1978年Geoghega等又將膠體金探針用于光鏡水平測定細(xì)胞表面標(biāo)志。但光鏡下觀察膠體金標(biāo)記物，所需金顆粒要大于20nm，且標(biāo)記物濃度要高這就限制了免疫金染色法(Immunogold Staining, IGS)在光鏡水平推廣應(yīng)用。1981年Danscher等用銀顯影法增強(qiáng)金顆粒的可見度，并提高了靈敏度。后來，Holgate等根據(jù)Danscher的方法將免疫金染色法與銀顯影相結(jié)合，建立免疫金銀染色法(Immunogold Silver Staining, IGSS)。1989年Spielberg F 等建立了斑點(diǎn)金免疫滲濾技術(shù)用于檢測艾滋病病毒抗體[4]。近年來，隨著人們對(duì)膠體金性質(zhì)的深入理解，膠體金技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)由免疫學(xué)滲透到生物傳感器、PCR技術(shù)及基因治療等領(lǐng)域。

3 膠體金技術(shù)在免疫學(xué)檢測中的應(yīng)用

3.1 在電鏡水平上的應(yīng)用 膠體金作為免疫標(biāo)記物最早用于電鏡檢測，主要是因?yàn)槟z體金有很高的電子密度，在電鏡下能顯示清晰可辨的顆粒?？乖贵w復(fù)合物的電子密度與其背景電子密度差異較小，電鏡下很難分辨這種結(jié)合，用高電子密度的膠體金標(biāo)記抗體能增強(qiáng)顯色結(jié)果，電鏡下能準(zhǔn)確的確定抗原分布。近年來膠體金技術(shù)在電鏡水平上的應(yīng)用已經(jīng)從對(duì)組織細(xì)胞抗原定位研究發(fā)展到基因水平，主要體現(xiàn)在染色體的基因定位、基因表達(dá)的檢測、特定核酸序列在細(xì)胞內(nèi)的空間分布及核酸復(fù)制過程的定性和定量分析等[5，6]。如鏈霉親和素-膠體金探針就能夠在染色體上對(duì)DNA序列超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行定位，可用于哺乳動(dòng)物組織成長及相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷。

3.2 在光鏡水平上的應(yīng)用 膠體金不僅可作為電鏡水平的標(biāo)記物，也適用于光鏡水平，各種細(xì)胞涂片、切片均可應(yīng)用。主要體現(xiàn)在：結(jié)合單克隆抗體技術(shù)檢測細(xì)胞懸液或培養(yǎng)的單層細(xì)胞膜表面抗原[7]，檢測培養(yǎng)的單層細(xì)胞胞內(nèi)抗原及組織中或亞薄切片中抗原的檢測。膠體金用于光鏡水平研究，其優(yōu)點(diǎn)是：不需要昂貴的熒光顯微鏡；彌補(bǔ)了其它標(biāo)記物不可避免的本底過高和內(nèi)部酶活性干擾等缺點(diǎn)；用硝酸銀可進(jìn)一步提高顯色效果。因此有取代傳統(tǒng)的熒光素、酶和放射性物質(zhì)標(biāo)記的趨勢。

3.3 膠體金同樣也可以用于肉眼水平的檢測，如凝集試驗(yàn)和膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn) （1）單分散的膠體金溶膠呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化。當(dāng)與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生專一性反應(yīng)后出現(xiàn)凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發(fā)生變化，同時(shí)顆粒發(fā)生沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無色，變化的速度和程度與被測物的量相關(guān)，可用肉眼觀察結(jié)果或測A580nm加以定量，后者靈敏度更佳。膠體金凝集試驗(yàn)的靈敏度優(yōu)于膠乳凝集試驗(yàn)玻片法。（2）膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)基本上采用“抗體-抗原-抗體-膠體金”夾心法，其基本原理是以微孔濾膜為載體包被抗原或抗體，加入待測標(biāo)本后，經(jīng)濾膜毛細(xì)管作用使標(biāo)本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金結(jié)合物達(dá)到檢測目的。根據(jù)檢測裝置不同可分為斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)(dot immuno gold filtration assay, DIFA)和膠體金免疫層析試驗(yàn)(gold immunochromatography assay, GICA)[9]。（3）90年代以來，艾滋病感染人數(shù)已呈急劇上升趨勢，對(duì)于艾滋病的檢測和防治成為一個(gè)緊迫的課題。傳統(tǒng)的檢測方法主要采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA法)，但該法操作程序復(fù)雜、時(shí)間長、成本高，給實(shí)驗(yàn)室快速診斷帶來不便。因此一種以膠體金為標(biāo)記物用于檢測艾滋病病毒抗體的滲濾試驗(yàn)由運(yùn)而生，確立了DIFA基本技術(shù)。其基本原理是將待測液(如血清)滴在一種預(yù)吸附有HIV抗原的特殊濾紙上，待測液中的抗體與濾紙上的抗原特異性結(jié)合，然后滴入金標(biāo)抗人免疫球蛋白探針(gold-antihuman-IgG)，抗人IgG結(jié)合抗體-抗原復(fù)合物，金顆粒被吸附在濾紙上而顯色紅色斑點(diǎn)，即為抗體陽性；反之，若無抗體，則金顆粒將全部通過濾紙不顯斑點(diǎn)，即為抗體陰性(附圖)。DIFA檢測操作步驟與ELISA法相同，差別在于加樣、反應(yīng)、和洗滌均通過滲濾完成，檢測全過程僅需幾分鐘，而靈敏度可達(dá)到ELISA水平。其原因在于：ELISA樣品中待檢抗原(或抗體)需經(jīng)擴(kuò)散才能與固相上的抗體(或抗原)反應(yīng)，并且如果反應(yīng)時(shí)間太短將降低靈敏度。而在膜滲濾法中，抗原充滿膜的微孔，待測液層滲濾時(shí)抗原抗體緊密接觸形成免疫濃縮，從而提高了免疫效率。此外，研究發(fā)現(xiàn)金顆粒越小活性越高，靈敏度越好，但小于3nm的膠體金顏色淺，不利于肉眼觀察。因此，必須選擇合適粒徑大小的膠體金，并結(jié)合一些信號(hào)放大系統(tǒng)[10，11]，盡可能提高靈敏度及延長保存時(shí)間。目前，夾心式抗體抗原法檢測HIV抗體也已有報(bào)道，并已應(yīng)用于臨床診斷。免疫層析是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方法[12，13]。膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合在一起的固相標(biāo)記免疫檢測技術(shù)，與DIFA不同點(diǎn)在于液體移動(dòng)方向不是徑向穿流，而是基于層析作用的橫向流動(dòng)。其原理是：以條行纖維層析材料為固相，樣品由于毛細(xì)作用在層析條上泳動(dòng)，此過程中樣品中的待測物與層析材料上針對(duì)待測物的受體(抗原或抗體)發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)，免疫復(fù)合物被富集或截留在檢測帶上，而游離標(biāo)記物則越過檢測帶與結(jié)合標(biāo)記物自動(dòng)分離，通過可目測的膠體金標(biāo)記物判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究表明微孔濾膜的選擇、處理及受體的固定決定著免疫層析的質(zhì)量：（1）在可選擇的濾膜如硝酸纖維素膜、尼龍膜、羧化纖維素膜、聚脂膜、純纖維素膜及玻璃纖維膜中，以硝酸纖維素膜(NCM)運(yùn)用較多。這主要得益于NCM的兩個(gè)特性：較高的蛋白質(zhì)吸附容量和良好的親水性。（2）受體的選擇需要具備一下要求：能夠與膜材料穩(wěn)定結(jié)合；具有較高的生物活性，保證有足夠的配體捕獲容量；具有較高的純度，保證特異性；具有良好的流動(dòng)性，可在層析帶上加入高效助溶劑、表面活性劑等。此外，受體包被量的選擇，篩選和純化抗體、制備標(biāo)記物等也是不容忽視的重要環(huán)節(jié)。近年來該技術(shù)發(fā)展迅猛，正向高靈敏、多項(xiàng)檢測和實(shí)現(xiàn)定量半定量等方向深入[14]。由此可見，在生物檢測中膠體金取代三大傳統(tǒng)標(biāo)記物用于肉眼水平的檢測，這除了膠體金本身具有的特點(diǎn)外還有以下原因：試劑和樣本用量少，樣本量可低至1～2μl；沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)；時(shí)間短，檢測速度快；實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以長期保存；不需γ-計(jì)數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測儀等貴重儀器。在以后的研究工作中，特別是在現(xiàn)地試驗(yàn)中將顯示其巨大的優(yōu)越性。

附圖 膠體金探針檢測HIV示意圖

3.4 應(yīng)用于流式細(xì)胞儀技術(shù) 應(yīng)用熒光素標(biāo)記的抗體通過流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析細(xì)胞表面抗原，是免疫學(xué)研究中的重要技術(shù)之一。但不同熒光素的光譜相互重疊，不能區(qū)分不同的標(biāo)記，發(fā)展受到限制。因此，必須尋找一種非熒光素標(biāo)記物用于流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，從而可同時(shí)進(jìn)行幾種標(biāo)記。Boehner等研究發(fā)現(xiàn)膠體金可以明顯改變紅色激光的散射角，他們將膠體金標(biāo)記的羊抗鼠Ig抗體應(yīng)用于流式細(xì)胞儀分析不同細(xì)胞的表面抗原。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠脾細(xì)胞可同時(shí)被熒光素和金標(biāo)抗體標(biāo)記，兩者互不干擾，并且金標(biāo)記的細(xì)胞在波長為632.8nm處，90度散射角可放大10倍以上。因此，膠體金可作為多參數(shù)細(xì)胞分析和分選的有效標(biāo)記物，用于各類細(xì)胞表面標(biāo)志與細(xì)胞內(nèi)含物的分析。

3.5 應(yīng)用于免疫印記技術(shù) 免疫印跡是一種比較新的免疫化學(xué)技術(shù)，是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質(zhì)分離，得到的區(qū)帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后用酶免疫法，免疫熒光或放射免疫分析(RIA)法進(jìn)行定量分析。膠體金也可用于該法的定量：轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體(一抗)作用后，再與金標(biāo)二抗反應(yīng)，充分漂洗后根據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可對(duì)樣品中的特異性抗原進(jìn)行定量。不僅如此，膠體金還可以用于該法進(jìn)行定位分析。楊中漢等人就利用此法對(duì)玉米精細(xì)胞膜特異糖蛋白進(jìn)行了定位，并且結(jié)合銀顯影放大技術(shù)，可增強(qiáng)金顆粒的可見性，大大提高了測定靈敏度，檢測下限可低至0.1ng[8]。膠體金應(yīng)用于免疫印記技術(shù)具有一下優(yōu)點(diǎn)：（1）信號(hào)本底比大；（2）無處理放射性同位素的麻煩；（3）結(jié)果可長期保存；（4）可采用銀放大技術(shù)，靈敏度至少可提高10倍。

3.6 膠體金技術(shù)在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用 近年來，研究人員根據(jù)膠體金的物化性質(zhì)，進(jìn)一步擴(kuò)展了膠體金標(biāo)記的生物檢測技術(shù)。（1）膠體金顆粒獨(dú)特的生物效應(yīng)、介電特性使得該技術(shù)在生物傳感器中的研究增多。葡萄糖氧化酶(GOD)薄膜可以作為測定血糖的生物傳感器，膠體金技術(shù)的引入大大增強(qiáng)了酶膜的活性[15,16]。研究發(fā)現(xiàn)，金的氧化還原電位為+1.68，有極強(qiáng)的奪電子能力，對(duì)于那些氧化還原電位較小的生物大分子參加的生化反應(yīng)具有很強(qiáng)的催化作用，能明顯提高生物大分子生物活性。同時(shí)，膠體金在表面等離子體基元共振(SPR)中的應(yīng)用顯著的增強(qiáng)了SPR的靈敏度[17]。Lyon LA等采用膠體金或金標(biāo)生物大分子修飾金膜，構(gòu)造SPR檢測系統(tǒng)的敏感薄膜，從而檢測到具有較大偏移的反射波谷，達(dá)到對(duì)SPR的放大作用[18]。Andrew通過對(duì)不同粒徑膠體金修飾的SPR進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)膠體金顆粒大小對(duì)SPR的響應(yīng)有很大影響：膠體金顆粒越大相應(yīng)的SPR曲線變化越明顯。（2）膠體金密度比較大，金標(biāo)抗體/抗原與相應(yīng)抗原/抗體結(jié)合后，復(fù)合物質(zhì)量有較大變化，可以用來提高石英晶體微天平(QCM)技術(shù)在DNA檢測方面的靈敏度[19]。雖然當(dāng)前這種靈敏度只能提高2-3倍左右，但金標(biāo)抗體能形成分子量巨大的復(fù)合物，所以在這方面有很大的應(yīng)用潛力。同時(shí)，膠體金顆粒具有良好的導(dǎo)熱特性，可以有效的提高PCR效率。Min Li等發(fā)現(xiàn)向PCR反應(yīng)體系中加入一定量(0.7nM)粒徑為13nm的膠體金顆粒后，冷熱轉(zhuǎn)換率大大提高、反應(yīng)時(shí)間縮短，且不影響產(chǎn)物量。研究發(fā)現(xiàn)，膠體金顆粒的加入可以使普通PCR檢測靈敏度提高5～10倍，而對(duì)于適時(shí)定量PCR至少提高104倍[20]。膠體金的引入對(duì)于降低成本、提高反應(yīng)效率和靈敏度具有重要意義。（3）膠體金具有良好的生物相容性以及極高的比重，可以作為基因運(yùn)載體應(yīng)用于基因治療，提高了基因?qū)氲乃矔r(shí)性和表達(dá)效率。人們對(duì)膠體金顆粒的免疫原性進(jìn)行試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，膠體金在半抗原載體和免疫增強(qiáng)佐劑方面也具有重要作用[21]。用膠體金作為半抗原載體來免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)，提高巨噬細(xì)胞吞噬作用；而膠體金作為佐劑對(duì)DNA疫苗的電穿孔擴(kuò)張具有免疫增強(qiáng)作用。另外，研究還發(fā)現(xiàn)膠體金在腫瘤放射療法方面也具有重要意義[22]。

4 膠體金技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

（1）膠體金標(biāo)記技術(shù)與免疫熒光、酶技術(shù)、免疫鐵蛋白、放射性同位素等標(biāo)記技術(shù)相比有其獨(dú)特的優(yōu)越性和更廣泛的用途。 膠體金標(biāo)記即可用于常規(guī)光鏡，也可用于熒光顯微鏡，其中光鏡應(yīng)用的IGSS法是迄今最敏感的免疫組化方法。同時(shí)由于金顆粒具有很強(qiáng)的激發(fā)電子能力，還可用于掃描電鏡和X射線衍射分析等。膠體金是高電子密度顆粒性標(biāo)記物，電鏡下分辨率高，對(duì)超微結(jié)構(gòu)遮蓋少，并易與其他顆粒性結(jié)構(gòu)相區(qū)別，具有較精確的定位能力。利用不同直徑膠體金顆粒標(biāo)記不同抗原，可實(shí)現(xiàn)電鏡下的雙重或多重免疫標(biāo)記。（2）免疫膠體金制備不需經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)交聯(lián)，多種生物大分子均可與金顆粒吸附形成復(fù)合物，且生物大分子活性保持不變。免疫金應(yīng)用于免疫層析快速診斷技術(shù)，大大提高了檢測速度，準(zhǔn)確可靠，特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測下限可達(dá)到1ng/ml；無污染，不含放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)；成本低廉，操作簡單，無需附加設(shè)備等，非常適合醫(yī)院、養(yǎng)殖場、診所和家庭等。但也曾有報(bào)道稱膠體金免疫層析快速診斷試紙條存在假陽性和漏檢率高的問題。假陽性或若陽性其主要原因是由于檢測時(shí)間過短，一般時(shí)間為5～10min；也有可能是強(qiáng)陽性樣品造成的拖帶現(xiàn)象；同時(shí)外界條件如溫度、濕度對(duì)其也有一定的影響。

5 結(jié)語

膠體金標(biāo)記對(duì)生物分子的活性影響較小，且能標(biāo)記很大一部分生物分子，是非常理想的標(biāo)記物。膠體金顆粒獨(dú)特的物理效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)使其在生物學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。隨著科學(xué)研究的不斷深入發(fā)展，基于膠體金應(yīng)用的新技術(shù)、新方法即將問世，為科學(xué)研究及臨床診斷開辟新的途徑。今后，膠體金技術(shù)在生物檢測及醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域會(huì)有更好的發(fā)展前景。